一种利用单层磷脂膜组装α-溶血素蛋白质纳米孔的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用单层磷脂膜组装形成α-溶血素七聚体生物纳米孔的方法，本发明专利技术将重组有野生型αHL基因的pT7质粒转入到BL21(DE3)pLys中，进行IPTG诱导后，用超滤离心管分子截留法纯化单体蛋白，并在DPhPC单层膜上实现αHL单体蛋白的组装，通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳证明了蛋白表达，纯化及组装结果。αHL七聚体生物纳米孔单通道电流记录特征良好。当制备的七聚体纳米孔用于单分子分析时，能够实现无机离子，小分子，DNA，RNA等检测。本发明专利技术制备纯化蛋白方法简单、经济、快速，并且可以适用于αHL的各种突变型蛋白，同源以及异源七聚体纳米孔制备。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种利用单层磷脂膜组装α-溶血素蛋白质纳米孔（protein nanopore）的方法，属于生物纳米材料领域。
技术介绍
纳米孔单分子检测是纳米、生物、化学、电子信息等多学科交叉融汇而成的一种新兴检测技术。α-溶血素（α-Hemolysin，αHL）是金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)分泌的一种分子量为33.2kD的水溶性蛋白质单体，在磷脂双分子层上可组装成分子量为232.4kD的蘑菇型七聚体蛋白质纳米孔，孔道总长约10nm，该纳米孔结构稳定，能够完整的装载在双层脂膜中不漏电，是理想化的纳米孔检测器件。αHL纳米孔从几何结构上分为cap、cis、stem三大区域，根据其分子结构或原子图谱，在不同部位进行蛋白修饰，可设计并制造出各种性能的蛋白质纳米管，从而研究空间效应、电荷效应等对通道与不同检测物作用的影响，实现单分子水平上的不同分析物的实时检测。分析物可包括：无机离子、有机分子、单链DNA/RNA、蛋白质等。 目前用于制备αHL纳米孔单体蛋白主要采用体外表达（In 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用单层磷脂膜组装α‑溶血素蛋白质纳米孔的方法，其特征在于：将αHL单体蛋白溶液浸没在DPhPC/十六烷混合液中，在单体蛋白溶液周围形成单层磷脂膜，αHL单体在单层磷脂膜上形成七聚体αHL蛋白质纳米孔，进一步经分离、纯化得到αHL蛋白质纳米孔。

【技术特征摘要】
1.一种利用单层磷脂膜组装α-溶血素蛋白质纳米孔的方法，其特征在于：将αHL单体蛋白溶液浸没在DPhPC/十六烷混合液中，在单体蛋白溶液周围形成单层磷脂膜，αHL单体在单层磷脂膜上形成七聚体αHL蛋白质纳米孔，进一步经分离、纯化得到αHL蛋白质纳米孔。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）αHL单体蛋白的表达
（2）αHL单体蛋白的纯化
（3）αHL单体蛋白在单层磷脂膜上形成七聚体αHL蛋白质纳米孔
用十六烷配制DPhPC，用细针在DPhPC液体中释放αHL单体蛋白溶液，在蛋白溶液与DPhPC接触面形成单层磷脂膜，αHL单体在单层磷脂膜上组装为蛋白质纳米孔，离心，收集下层液体进行SDS-PAGE电泳；
（4）SDS-PAGE切胶法纯化αHL蛋白质纳米孔。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤（1）中，将αHL基因重组在pT7质粒上，转化至BL21(DE3)pLys，IPTG诱导表达目的蛋白，收集细胞并进行裂解。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤（2）中，将细胞裂解上清液加入截留分子量为50kD的超滤管（Millpore），5000...

【专利技术属性】
技术研发人员：张亚妮，张春萍，王莹，段静，亢晓峰，
申请(专利权)人：西北大学，
类型：发明
国别省市：陕西;61