一种利用单层磷脂膜组装α-溶血素蛋白质纳米孔的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用单层磷脂膜组装形成α-溶血素七聚体生物纳米孔的方法，本发明专利技术将重组有野生型αHL基因的pT7质粒转入到BL21(DE3)pLys中，进行IPTG诱导后，用超滤离心管分子截留法纯化单体蛋白，并在DPhPC单层膜上实现αHL单体蛋白的组装，通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳证明了蛋白表达，纯化及组装结果。αHL七聚体生物纳米孔单通道电流记录特征良好。当制备的七聚体纳米孔用于单分子分析时，能够实现无机离子，小分子，DNA，RNA等检测。本发明专利技术制备纯化蛋白方法简单、经济、快速，并且可以适用于αHL的各种突变型蛋白，同源以及异源七聚体纳米孔制备。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种利用单层磷脂膜组装α-溶血素蛋白质纳米孔（protein nanopore）的方法，属于生物纳米材料领域。
技术介绍
纳米孔单分子检测是纳米、生物、化学、电子信息等多学科交叉融汇而成的一种新兴检测技术。α-溶血素（α-Hemolysin，αHL）是金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)分泌的一种分子量为33.2kD的水溶性蛋白质单体，在磷脂双分子层上可组装成分子量为232.4kD的蘑菇型七聚体蛋白质纳米孔，孔道总长约10nm，该纳米孔结构稳定，能够完整的装载在双层脂膜中不漏电，是理想化的纳米孔检测器件。αHL纳米孔从几何结构上分为cap、cis、stem三大区域，根据其分子结构或原子图谱，在不同部位进行蛋白修饰，可设计并制造出各种性能的蛋白质纳米管，从而研究空间效应、电荷效应等对通道与不同检测物作用的影响，实现单分子水平上的不同分析物的实时检测。分析物可包括：无机离子、有机分子、单链DNA/RNA、蛋白质等。 目前用于制备αHL纳米孔单体蛋白主要采用体外表达（In Vitro transcription and translation，IVTT）方法制备，七聚体纳米孔的组装也基本是在双分子层膜上实现，如：兔血红细胞膜（rabbit red blood cell membrane，rRBCM）、蛋黄卵磷脂、人工脂双层。这些方法步骤繁琐、耗时、所需花费较高，且产量有限，限制了αHL纳米孔的进一步应用和研究。
技术实现思路
r> 本专利技术的目的是提供一种简单易行、在磷脂单层膜上组装制备αHL蛋白质纳米孔的方法。 本专利技术实现过程如下： 1、一种利用单层磷脂膜组装α-溶血素（α-Hemolysin，αHL）蛋白质纳米孔的方法，其特征在于：将αHL单体蛋白溶液浸没在DPhPC/十六烷混合液中，在单体蛋白溶液周围形成单层磷脂膜，αHL单体在单层磷脂膜上形成七聚体αHL蛋白质纳米孔，进一步经分离、纯化得到αHL蛋白质纳米孔。 2、根据权利要求1所述方法，其特征在于包括以下步骤： （1）αHL单体蛋白的表达 将αHL基因重组在pT7质粒上，转化至BL21(DE3)pLys，IPTG诱导表达目的蛋白，收集细胞并进行裂解； （2）αHL单体蛋白的纯化 将细胞裂解上清液加入截留分子量为50kD的超滤管（Millpore），5000r/min离心10min，取下层液体加入截留分子量为30kD（Millpore）的超滤管，5000r/min离心10min，取上层液体，即为αHL单体蛋白溶液； （3）αHL单体蛋白在单层磷脂膜上形成七聚体αHL蛋白质纳米孔 用十六烷配制DPhPC（磷脂，1，2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosp- hocholine），即油脂混合液，用细针在DPhPC液体中释放αHL单体蛋白溶液，在蛋白溶液与DPhPC接触面形成单层磷脂膜，αHL单体在单层磷脂膜上组装为蛋白质纳米孔，离心，收集下层液体进行SDS-PAGE电泳； （4）SDS-PAGE切胶法纯化αHL蛋白质纳米孔 SDS-PAGE电泳完毕后，将凝胶的1/5切下，放入考马斯亮蓝G250染色液中染色，另外4/5胶存于4℃；将染好的凝胶放入脱色液中脱色，直至蛋白条带清晰可见；将此胶与未染色的凝胶对比，切下αHL蛋白质纳米孔所在区域，加入超纯水，-80℃反复冻融，低温离心收集上清液体，真空冷冻干燥，残留物用超纯水溶解，用SDS-PAGE凝胶分析并进行蛋白定量； （5）α-溶血素蛋白质纳米孔的检测方法 将预先打好小孔的Teflon膜装在电解槽中央，隔电解槽为两个小槽，用毛细管在孔周围滴加含1%戊烷的戊烷和十六烷的混合液，在两槽中各添加1400μL的10mM Tris-HCl（含1M KCl），并用毛细管滴加磷脂，使液面缓慢没过小孔，用Ag/AgCl电极检测跨膜电势，使膜电流值在120pA，将αHL蛋白质纳米孔加入，采集和分析αHL蛋白质纳米孔单孔电流信号。 传统方法制备αHL蛋白质纳米孔是利用兔血红细胞膜聚合αHL七聚体，聚合混合物中有过多杂蛋白，不利于后续蛋白孔的纯化。专利技术人发现在DPhPC单层膜上能够对αHL进行七聚体组装，且易于分离纯化，有利于大量制备αHL七聚体。 附图说明 图1 为αHL单体蛋白表达及纯化结果在12%的SDS-PAGE电泳结果图； 图2 为αHL单体蛋白溶液在油脂混合液中形成单层膜的示意图； 图3为αHL单体蛋白分别在兔血红细胞膜（双层膜）以及单层磷脂膜上形成的七聚体在7% SDS-PAGE的电泳结果图； 图4为切胶纯化后的αHL七聚体蛋白SDS-PAGE结果图； 图5为两种七聚体的单通道记录结果：B C分别为七聚体蛋白在+40mV和+120mV的单通道记录图，其中左边为αHL在rRBCM中形成的七聚体的单通道记录，右边为αHL在油脂混合液中形成的七聚体的单通道记录图。 具体实施方式 以下实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所使用的材料、试剂等如无特殊说明，均可从商业途径得到。实验涉及的仪器为垂直电泳仪，凝胶成像系统以及单分子电子检测系统(主要包括 Axon 200B放大器，数-模转化器和函数发生器)。 具体地说，本专利技术在单层磷脂膜上组装αHL蛋白质纳米孔包括以下步骤： （1）αHL单体蛋白的表达 将αHL基因重组在pT7质粒上，转化至BL21(DE3)pLys，IPTG诱导表达目的蛋白，收集细胞并进行裂解。 （2）αHL单体蛋白的纯化 将细胞裂解上清液加入截留分子量为50kD的超滤管（Millpore），5000r/min离心10min，取下层液体加入截留分子量为30kD（Millpore）的超滤管，5000r/min离心10min，取上层液体，即为αHL单体蛋白溶液（如图1结果所示）。 （3）αHL单体蛋白在单层磷脂膜上进行七聚体组装 用十六烷配制DPhPC（5-10mM），用细针在DPhPC液体中释放αHL单体蛋白溶液，在蛋白溶液与DPhPC接触面形成具有单层膜，αHL单体即在单层膜上组装。37℃放置若干时间，11000r/min离心，去上清油层，收集下层液体，进行SDS-PAGE电泳； 图2为 αHL单体蛋白溶液在油脂混合液中形成单层膜的示意图。 （4）SDS-PAGE切胶法纯化αHL七聚体蛋白。 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用单层磷脂膜组装α‑溶血素蛋白质纳米孔的方法，其特征在于：将αHL单体蛋白溶液浸没在DPhPC/十六烷混合液中，在单体蛋白溶液周围形成单层磷脂膜，αHL单体在单层磷脂膜上形成七聚体αHL蛋白质纳米孔，进一步经分离、纯化得到αHL蛋白质纳米孔。

【技术特征摘要】
1.一种利用单层磷脂膜组装α-溶血素蛋白质纳米孔的方法，其特征在于：将αHL单体蛋白溶液浸没在DPhPC/十六烷混合液中，在单体蛋白溶液周围形成单层磷脂膜，αHL单体在单层磷脂膜上形成七聚体αHL蛋白质纳米孔，进一步经分离、纯化得到αHL蛋白质纳米孔。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）αHL单体蛋白的表达
（2）αHL单体蛋白的纯化
（3）αHL单体蛋白在单层磷脂膜上形成七聚体αHL蛋白质纳米孔
用十六烷配制DPhPC，用细针在DPhPC液体中释放αHL单体蛋白溶液，在蛋白溶液与DPhPC接触面形成单层磷脂膜，αHL单体在单层磷脂膜上组装为蛋白质纳米孔，离心，收集下层液体进行SDS-PAGE电泳；
（4）SDS-PAGE切胶法纯化αHL蛋白质纳米孔。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤（1）中，将αHL基因重组在pT7质粒上，转化至BL21(DE3)pLys，IPTG诱导表达目的蛋白，收集细胞并进行裂解。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤（2）中，将细胞裂解上清液加入截留分子量为50kD的超滤管（Millpore），5000...

【专利技术属性】
技术研发人员：张亚妮，张春萍，王莹，段静，亢晓峰，
申请(专利权)人：西北大学，
类型：发明
国别省市：陕西;61