用于癌症免疫疗法的ROR1(NTRKR1)特异性的嵌合抗原受体制造技术

本发明专利技术涉及嵌合抗原受体(CAR)，其是能够重定向对于挑选的膜抗原的免疫细胞特异性和反应性的重组嵌合蛋白质,以及更特别地，其中结合胞外配体是来源于ROR1单克隆抗体的scFV,其赋予对抗ROR1阳性细胞的特异性免疫。具有这样的CAR的工程化的免疫细胞特别地适于治疗淋巴瘤和白血病,以及实体瘤例如乳腺、结肠、肺和肾脏肿瘤。

ROR1 (NTRKR1) specific chimeric antigen receptor for cancer immunotherapy

The invention relates to a chimeric antigen receptor (CAR), which is able to redirect the recombinant chimeric protein for membrane antigen selection of immune cell specificity and reactivity, and more particularly, which binds to the extracellular ligand from ROR1 monoclonal antibody scFV, which gives a specific immune against ROR1 positive cells. Engineered immune cells with such CAR are particularly well suited for the treatment of lymphomas and leukemias, and for solid tumors such as breast, colon, lung, and kidney tumors.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于癌症免疫疗法的ROR1(NTRKR1)特异性的嵌合抗原受体专利
本专利技术涉及嵌合抗原受体(CAR)，其是能够重定向对于ROR1的免疫细胞特异性和反应性的重组嵌合蛋白质，ROR1是在大多数骨髓细胞上发现并且被用于在患者中诊断慢性淋巴细胞白血病(CLL)或实体瘤例如乳腺、结肠、肺和肾脏肿瘤的细胞表面糖蛋白。当其在T细胞或NK细胞中被表达时，根据本专利技术所述的CAR特别地可用于治疗带有ROR1抗原的恶性细胞。所产生的工程化的免疫细胞展示高水平的对于恶性细胞的特异性,赋予免疫疗法以安全性和效率。专利技术背景过继性免疫疗法涉及离体产生的自体抗原特异性的T细胞的转移,是一种有前途的用来治疗病毒感染和癌症的策略。用于过继性免疫疗法的T细胞可以或者通过抗原特异性的T细胞的扩增或者通过遗传工程重定向T细胞而产生(Park,Rosenberg等人2011)。病毒抗原特异性的T细胞的转移是一种得到确认的用于治疗与移植相关联的病毒感染和与稀有病毒有关的恶性肿瘤的方法。已经显示肿瘤特异性的T细胞的分离和转移在治疗黑素瘤方面是成功的。通过转基因T细胞受体或嵌合抗原受体(CAR)的遗传转移，已经成功地在T细胞中产生了新的特异性(Jena,Dotti等人2010)。在图1中呈现了3代的CAR的略图。CAR是合成的受体，其由与单个融合分子中一个或更多个信号传导结构域缔合的靶向部分组成。一般而言,CAR的结合部分由单链抗体(scFv)的抗原结合结构域组成，包含通过柔性接头连接的单克隆抗体的轻并且可变的片段。也已经成功地使用了基于受体或配体结构域的结合部分。第一代CAR的信号传导结构域源自于CD3ζ的胞质区或Fc受体γ链。已经显示第一代CAR成功地重定向T细胞的细胞毒性。然而,它们未能提供持续的扩增和体内抗肿瘤活性。已经添加了来自共刺激分子的信号传导结构域以及跨膜和铰链结构域来形成第二和第三代的CAR,导致在人中某些成功的治疗性试验,其中可以重定向T细胞使其对抗表达CD19的恶性细胞(June等人,2011)。然而,针对CD19ScFv使用的信号传导结构域、跨膜结构域和共刺激结构域的特定组合是相当抗原特异性的并且不能被扩展到任何抗原标记。慢性淋巴细胞白血病(CLL)是由执业血液学家管理的一种最通常诊断的白血病。持续多年，患有CLL的患者一直被看作类似的具有长的自然史并且仅仅边际有效的治疗，其很少产生完全应答。最近,与VH突变状态和相关联的ZAP-70过表达、破坏的p53功能和染色体畸变的生物学显著性相关的几个重要的观察已经导致能够鉴定处于早期疾病发展和弱生存力的高风险的患者。与这些研究同时,包括核苷类似物、单克隆抗体利妥昔单抗和阿仑单抗在内的几种治疗已经被引入。当被用作有症状的CLL的初始治疗时，这些治疗的组合在临床试验中已经导致高度完全的和总的响应速率。因此,CLL和治疗的初始风险分层化的复杂性已经显著地增大了。此外,当这些初始治疗没有效果时,对患有氟达拉滨顽固性疾病的CLL患者的方法可能是相当具有挑战性的(ByrdJ.C等人,2014)。针对慢性淋巴细胞白血病(CLL)的免疫疗法的一种候选抗原是酪氨酸蛋白激酶跨膜受体ROR1(也被称为NTRKR1；UniProtKB/TrEMBL)条目:Q01973)。ROR1(受体酪氨酸激酶样孤儿受体1)是一种包含胞外免疫球蛋白(Ig)样、三环域和卷发样半胱氨酸富集域的120-kDa糖蛋白(图2)。被这种基因编码的蛋白是在中枢神经系统中调节轴突生长的受体酪氨酸激酶。它是I型膜蛋白并且属于ROR亚族的细胞表面受体(Reddy等人,1997)。尽管在患有关于正常白血球的CLL的患者中ROR1蛋白表达以及它在CLL的病理学中的作用值得进一步研究，ROR1可能是用于癌症免疫疗法的合适的靶(Daneshmanesh等人；2008)。ROR1实际上是在多种B细胞恶性肿瘤上被表达的，而且也在包括乳腺、结肠、肺和肾脏肿瘤在内的某些实体瘤的亚组上被表达的。相信ROR1在致癌的信号传导中起作用以改善肿瘤细胞在上皮肿瘤中的生存力。重要地,ROR1不在除了脂肪和胰腺组织之外的重要器官上被表达,这减小了来自杀伤正常细胞的潜在毒性(Hudecek等人,2013)。ROR1是在胚胎形成期间被表达的，但是在正常的成熟组织中不存在,除了不成熟的B细胞前体亚组以及在脂肪细胞上低水平的表达以外(Hudecek等人,2010；Matsuda等人,2001)。通过转录的剖析首次证明了ROR1在B细胞慢性淋巴细胞白血病(B-CLL)中被表达(Klein等人,2001；Rosenwald等人,2001)并且随后在包括套细胞淋巴瘤(MCL)、具有t(1；19)染色体易位的急性淋巴母细胞性白血病(ALL)和肺、乳腺、结肠、胰腺、肾和卵巢癌亚组在内的许多癌症的表面上鉴定了ROR1(Baskar等人,2008；Bicocca等人,2012；Daneshmanesh等人,2008；Dave等人,2012；Fukuda等人,2008；Yamaguchi等人,2012；Zhang等人,2012a,2012b)。在肺腺癌和t(1；19)ALL这两者中,ROR1在致癌的信号传导和ROR1的敲减方面与siRNA合作暴露了关于这种分子在保持肿瘤细胞生存力方面的关键作用(Bicocca等人,2012；Choudhury等人,2010；Gentile等人,2011；Yamaguchi等人,2012)。因此,ROR1损失不能容易地被肿瘤忍受，使得它成为可能被广泛地应用的CAR定向的T细胞疗法的有吸引力的候选者。因此本专利技术人已经考虑到通过利用表达CAR的T细胞，ROR1可能是用于治疗CLL以及实体瘤例如乳腺、结肠、肺、卵巢和肾脏肿瘤的有价值的靶抗原。StanleyRiddell博士和LaurenceCooper博士的实验室先前已经工程化并且确认了分别地包含4A5和2A2scFvs的抗ROR1scCAR(Cooper等人2010；Hudecek等人,2013)。特别地,Hudecek等人公开了抗ROR1scCAR，其包含不同长度的IgG4铰链和CD28跨膜结构域。仍然存在着对通过设计CAR结构并且利用合适的组件来改进CAR功能的需要，因为这些参数发挥着重要作用并且精细调谐是必需的。因此,作为先前策略的备选,本专利技术提供ROR1特异性的CAR,其可以在免疫细胞中被表达以靶向ROR1恶性细胞，具有显著的临床优点。本专利技术人已经发现:通过把CAR结构与合适组件的选择结合,他们可以得到对于癌性的靶细胞具有高细胞毒性的ROR1特异性的单链CAR。专利技术概述本专利技术人已经生产了具有不同的结构并且包含来源于不同的ROR1特异性抗体的不同scFV的ROR1特异性的CAR。正如在图4中阐明的那样，根据本专利技术的ROR1(NTRKR1)特异性的嵌合抗原受体(CAR)可以具有选自V1至V6的一种多肽结构，所述结构包含结合细胞外配体的结构域，其包括来自单克隆抗ROR1抗体的VH和VL、铰链、跨膜结构域和胞质结构域，包括CD3ζ信号传导结构域和来自4-1BB的共刺激结构域在内。更特别地,正如在图4中阐明的那样，根据本专利技术的ROR1(NTRKR1)特异性的嵌合抗原受体(CAR)可以具有选自V3、V5本文档来自技高网...

【技术保护点】
ROR1(NTRKR1)特异性的嵌合抗原受体(CAR)，其具有选自如在图4中阐明的V3、V5和V1的一种多肽结构，所述结构包含胞外配体结合结构域，该胞外配体结合结构域包含来自单克隆抗ROR1抗体的VH和VL、CD8α跨膜结构域和胞质结构域，所述胞质结构域包括CD3δ信号传导结构域和来自4‑1BB的共刺激结构域。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.07.29 DK PA2014704651.ROR1(NTRKR1)特异性的嵌合抗原受体(CAR)，其具有选自如在图4中阐明的V3、V5和V1的一种多肽结构，所述结构包含胞外配体结合结构域，该胞外配体结合结构域包含来自单克隆抗ROR1抗体的VH和VL、CD8α跨膜结构域和胞质结构域，所述胞质结构域包括CD3δ信号传导结构域和来自4-1BB的共刺激结构域。2.根据权利要求1的ROR1(NTRKR1)特异性的嵌合抗原受体(CAR),其中所述的CD8α跨膜结构域与SEQIDNO.6具有至少80％,优选地至少90％,更优选地至少95％,以及甚至更优选地至少99％的序列同一性。3.根据权利要求1或2的ROR1(NTRKR1)特异性的嵌合抗原受体(CAR),其中所述的铰链选自CD8α铰链、IgG1铰链和FcγRIIIα铰链。4.根据权利要求1或2的ROR1(NTRKR1)特异性的嵌合抗原受体(CAR),其中分别对于结构V3、V5和V1，所述的铰链与SEQIDNO.4(CD8α)、SEQIDNO.5(IgG1)和SEQIDNO.3(FcγRIIIα)具有至少80％,优选地至少90％,更优选地至少95％,以及甚至更优选地至少99％的序列同一性。5.根据权利要求1至4中任意一项的ROR1特异性的CAR,其中所述铰链是与SEQIDNO.4具有至少80％序列同一性的CD8α铰链。6.根据权利要求1至4中任意一项的ROR1特异性的CAR,其具有多肽结构V3，该多肽结构V3包含具有SEQIDNO.4中所列的氨基酸序列的CD8α铰链和具有SEQIDNO:6中所列的氨基酸序列的CD8α跨膜结构域。7.根据权利要求1至4中任意一项的ROR1特异性的CAR，其中所述铰链是与SEQIDNO.5具有至少80％同一性的IgG1铰链。8.根据权利要求1至4中任意一项的ROR1特异性的CAR,其具有多肽结构V5，该多肽结构V5包含具有SEQIDNO.5中所列的氨基酸序列的IgG1铰链和具有SEQIDNO.6中所列的氨基酸序列的CD8α跨膜结构域。9.根据权利要求1至4中任意一项的ROR1特异性的CAR,其中所述铰链是与SEQIDNO.3具有至少80％序列同一性的FcγRIIIα铰链。10.根据权利要求1至4中任意一项的ROR1特异性的CAR,其具有多肽结构V1，该多肽结构V1包含具有SEQIDNO.3中所列的氨基酸序列的FcγRIIIα铰链和具有SEQIDNO:6中所列的氨基酸序列的CD8α跨膜结构域。11.根据权利要求1至10中任意一项的ROR1特异性的嵌合抗原受体,其中所述胞外配体结合结构域包含:-可变的重VH链，其包含来自SEQIDNO.54(CDR-H1)、SEQIDNO:55(CDR-H2)和SEQIDNO:56(CDR-H3)的小鼠单克隆抗体H10的CDR,和；-可变的轻VL，其包含来自SEQIDNO.59(CDR-L1)、SEQIDNO:60(CDR-L2)和SEQIDNO:61(CDR-L3)的小鼠单克隆抗体H10的CDR。12.根据权利要求1至10中任意一项的ROR1特异性的嵌合抗原受体,其中所述胞外配体结合结构域包含:-可变的重VH链，其包含来自SEQIDNO.28(CDR-H1)、SEQIDNO.29(CDR-H2)和SEQIDNO.30(CDR-H3)的小鼠单克隆抗体D10的CDR,和；-可变的轻VL，其包含来自SEQIDNO.33(CDR-L1)、SEQIDNO:34(CDR-L2)和SEQIDNO:35(CDR-L3)的小鼠单克隆抗体D10的CDR。13.根据权利要求1至10中任意一项的ROR1特异性的嵌合抗原受体,其中所述胞外配体结合结构域包含VH和VL链，其分别地与SEQIDNO:53(H10-VH)和SEQIDNO:58(H10-VL)具有至少80％,优选地至少90％,更优选地至少95％,以及甚至更优选地至少99％的序列同一性。14.根据权利要求1至10中任意一项的ROR1特异性的嵌合抗原受体,其中所述胞外配体结合结构域包含VH和VL链，其分别地与SEQIDNO:27(D10-VH)和SEQIDNO:32(D10-VL)具有至少80％,优选地至少90％,更优选地至少95％,以及甚至更优选地至少99％的序列同一性。15.根据权利要求1至14中任意一项的ROR1特异性的嵌合抗原受体,其中所述胞外配体结合结构域包含VH和VL链，所述VH和VL链来自已经被人源化的H10或D10抗体。16.根据权利要求15的ROR1特异性的嵌合抗原受体,其中所述胞外配体结合结构域包含VH和VL链,其中-VH链具有被SEQIDNO:57编码的多肽,和-VL链具有被SEQIDNO:62编码的多肽。17.根据权利要求15的ROR1特异性的嵌合抗原受体,其中所述胞外配体结合结构域包含:-VH链具有SEQIDNO:31编码的多肽,和-VL链具有SEQIDNO:36编码的多肽。18.根据权利要求1至10中任意一项的ROR1特异性的嵌合抗原受体,其中所述CAR多肽与SEQIDNO:117(H10v3-CAR序列)具有至少80％,优选地至少90％,更优选地至少95％,以及甚至更优选地至少99％的序列同一性。19.根据权利要求1至10中任意一项的ROR1特异性的嵌合抗原受体,其中所述CAR多肽...

【专利技术属性】
技术研发人员：C·西弗曼尼奥伊，
申请(专利权)人：瑟勒提斯公司，
类型：发明
国别省市：法国,FR