用于癌症免疫疗法的CD123特异性嵌合抗原受体制造技术

本发明专利技术涉及嵌合抗原受体(CAR)，其是能够重新定向免疫细胞针对选定的膜抗原的特异性和反应性的重组嵌合蛋白，并且更具体地，其中胞外配体结合是源自CD123单克隆抗体的scFV，赋予针对CD123阳性细胞的特异性免疫性。赋予这种CAR的工程化免疫细胞特别适用于治疗淋巴瘤和白血病。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及嵌合抗原受体(CAR)，其是能够针对选定的膜抗原重新定向免疫细胞特异性和反应性的重组嵌合蛋白，并且更具体地其中胞外配体结合是源自CD123单克隆抗体的scFV，赋予对于CD123阳性细胞的特异性免疫性。已经确定与正常的造血干细胞相比，白细胞介素3受体α链(CD123)经常在白血病肿瘤细胞上过表达(特别是在急性骨髓性白血病(AML)的情况下)。根据本专利技术的被赋予CAR的工程化免疫细胞在治疗淋巴瘤和白血病方面显示出更高的效力。
技术介绍
过继性免疫疗法(adoptive immunotherapy)(其涉及体外生成的自体抗原特异性T细胞的转移)，是治疗病毒感染和癌症的有希望的策略。可以通过抗原特异性T细胞的扩增或T细胞的重新定向(通过基因工程)来产生用于过继性免疫疗法的T细胞(Park,Rosenberg et al.2011)。病毒抗原特异性T细胞的转移是用于治疗移植相关的病毒感染和罕见的病毒相关的恶性肿瘤的已建立的程序。类似地，在治疗黑色素瘤中，肿瘤特异性T细胞的分离和转移已显示是成功的。通过转基因T细胞受体或嵌合抗原受体(CAR)的基因转移，已成功地产生在T细胞中的新型特异性(Jena,Dotti et al.2010)。CAR是合成受体，其由与单融合分子中的一个或多个信号结构域相关联的靶向部分组成。通常，CAR的结合部分由单链抗体(scFv)的抗原结合结构域组成，包含通过柔性接头(linker)结合的单克隆抗体的轻片段和可变片段。也已成功地使用基于受体或配体结构域的结合部分。第一代CAR的信号结构域(signaling domain)是源自CD3ζ或Fc受体γ链的胞质区。第一代CAR已显示出成功地重新定向T细胞的细胞毒性，然而，它们未能提供体内长期扩增和抗肿瘤活性。已单独地(第二代)或组合地(第三代)加入来自共刺激分子(包括CD28、OX-40(CD134)、和4-1BB(CD137))的信号结构域，以增强生存率和增加CAR修饰T细胞的增殖。CAR已成功地使得T细胞针对在来自各种恶性肿瘤(包括淋巴瘤和实体瘤)的肿瘤细胞的表面上表达的抗原重新定向(Jena,Dotti et al.2010)。同时，用于急性骨髓性白血病(AML)的诱导治疗已经大体保持不变近50年并且AML仍然是预后不良的疾病。急性骨髓性白血病(AML)是其特征为在骨髓中不成熟的骨髓细胞的快速增殖，从而导致不正常的造血功能的疾病。虽然标准的诱导化疗可以诱导完全缓解，但许多患者最终复发和死于该疾病，从而要求开发针对AML的新疗法。在AML细胞的免疫表型分型的最新进展已经揭示了若干AML相关的细胞表面抗原，其可以作为用于未来疗法的靶。白细胞介素3受体α链(IL-3Rα；CD123–NCBI参考：NP_001254642)已被确定为潜在的免疫治疗靶，因为，与正常造血干细胞相比，它在AML肿瘤细胞上过表达。另外，已经完成对于CD123特异性疗法的两个I期临床试验，其中两种药物均显示良好的安全性曲线(ClinicalTrials.gov ID:NCT00401739和NCT00397579)。不幸的是，这些CD123靶向药物具有有限的功效，表明需要替代的并且更有效和特异性的靶向CD123的疗法来观察到抗白血病活性。用于治疗白血病的可能更有效的替代疗法可以是使用表达以MHC非依赖性方式针对细胞表面肿瘤相关抗原(TAA)重新定向T细胞特异性的嵌合抗原受体(CAR)的T细胞。已经开发了用于治疗B细胞恶性肿瘤的靶向各种抗原的几组CAR。然而，用于治疗AML的CAR工程化T细胞仍然是很少的。具体地，仍然存在对于改进显示更好的与T细胞增殖的相容性的CAR的构建的需要，以允许表达这种CAR的细胞达到显著的临床优势。此外,存在改进具有增殖和选择性地靶向表达CD123的细胞的能力的CD123 CAR的需要。进一步地，使用表达靶向CD123的免疫T细胞的这种CAR结合细胞毒性化疗剂作为通常用作抗癌治疗的治疗仍然是问题。已开发多种细胞毒性剂如抗代谢物、烷化剂、蒽环类(anthracycline)、DNA甲基转移酶抑制剂、铂化合物和纺锤体毒物(spindle poison)来杀死癌细胞，特别是表达CD123的癌细胞。由于它们的非特异性毒性，这些化疗剂可能不利于强健的抗肿瘤免疫活性T细胞的建立。靶向细胞增殖途径的基于小分子的疗法也可能妨碍抗肿瘤免疫性的建立。因此，还存在开发具有特异性并与药物，特别是抗癌化疗剂，如影响细胞增殖的那些的使用相容的靶向CD123的T细胞的需要。因此，为了连同化疗一起来使用“现成的(off-the shelf)”异基因(allogeneic)治疗性细胞，本专利技术人开发了将异基因T细胞工程化为较少异源性且耐化疗剂的方法。此策略提供的治疗益处可以由化疗和免疫疗法之间的协同效应而强化。此外，耐药性还可以受益于选择性地扩增工程化T细胞的能力从而避免由低效率的基因转移到这些细胞所引起的问题。
技术实现思路
本专利技术人已经生成了CD123特异性CAR，其具有不同的设计并且包含源自CD123特异性抗体的不同的scFv。这些CD123特异性CAR被无差别地指定为CD123特异性CAR或抗CD123 CAR、或123CAR、或“本专利技术的CAR”。具体地，本专利技术人已经开发了CD123特异性CAR，其包含源自具有不同结构的Klon43的scFV，以及确定高度特异性的和非常有选择性的CAR结构，其结合于表达CD123的细胞并选择性地破坏表达CD123的癌细胞。在体外非特异性活化(例如，用抗CD3/CD28涂覆珠和重组IL2)之后，使用病毒转导用表达这些CAR的多核苷酸转化来自供体的T细胞。在某些情况下，进一步工程化T细胞以产生非同种异体反应性(non-alloreactive)T细胞，更具体地通过破坏(disruption)TCR(αβ–T细胞受体)的组件来防止移植物(graft)相对于宿主反应。进一步工程化T细胞以产生对抗癌药物具有耐受性的T细胞，以结合所述经典的抗癌药物使用。得到的工程化T细胞在不同程度上显示出针对CD123阳性细胞的体外反应性，表明本专利技术的CAR有助于T细胞的抗原依赖性活化以及增殖，使得它们可用于免疫疗法。得到的工程化T细胞显示出针对CD123阳性细胞的体内反应性并显著减少体内癌细胞的数目。设计本专利技术的工程化T细胞以显示出针对CD123阳性细胞的体内反应性，可以连同抗癌药物一起使用，并且耐受良好。在具体实施方式中，即使在多次给予以后，本专利技术的工程化T细胞仍然是有效的，使得它们可以作为第一治疗(诱导(induction))、作为巩固(consolidation)治疗、作为与经典的抗癌化疗结合的治疗用于免疫疗法。在本说明书中详细说明编码本专利技术的CAR的多肽和多核苷酸序列。本专利技术的工程化免疫细胞特别可用于治疗应用，如B细胞淋巴瘤或白血病治疗。附图说明图1：根据本专利技术的工程化免疫细胞的示意图。在此图中呈现的工程化免疫细胞是用编码CAR的逆转录病毒多肽转导的T细胞。进一步工程化这种T细胞以允许更好和更安全地植入患者，其在本专利技术的框架内是可选的。X基因可以是例如表达TCR的组件(TCRα或TCRβ)的基因，Y可以是涉及T细胞对于免疫抑制药本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种CD123特异性嵌合抗原受体(123CAR)，具有选自如图2中示出的V1、V3和V5的多肽结构的一种，所述结构包含含有来自单克隆抗CD123抗体的VH和VL的胞外配体结合结构域、铰链、跨膜结构域、包括CD3ζ信号结构域和来自4‑1BB的共刺激结构域的胞质结构域，所述123CAR具有与SEQ ID NO.42、SEQ ID NO.44或SEQ ID NO.46至少80％的序列一致性。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.03.19 DK PA2014701371.一种CD123特异性嵌合抗原受体(123CAR)，具有选自如图2中示出的V1、V3和V5的多肽结构的一种，所述结构包含含有来自单克隆抗CD123抗体的VH和VL的胞外配体结合结构域、铰链、跨膜结构域、包括CD3ζ信号结构域和来自4-1BB的共刺激结构域的胞质结构域，所述123CAR具有与SEQ ID NO.42、SEQ ID NO.44或SEQ ID NO.46至少80％的序列一致性。2.根据权利要求1所述的具有如图2所示的多肽结构V3的CD123特异性嵌合抗原受体(123CAR)，其中，所述123CAR具有与SEQ ID N NO.44至少80％的序列一致性。3.根据权利要求1或2所述的具有如图2所示的多肽结构V3的CD123特异性嵌合抗原受体(123CAR)，所述结构包含来自单克隆抗CD123抗体的胞外配体结合结构域VH和VL，所述单克隆抗CD123抗体包含以下CDR序列：GFTFTDYY(SEQ ID NO.67)、RSKADGYTT(SEQ ID NO.68)、ARDAAYYSYYSPEGAMDY(SEQ ID NO.69)、和QNVDSA(SEQ ID NO.70)、SAS(SEQ ID NO.71)、QQYYSTPWT(SEQ ID NO.72)，并且所述结构包含：铰链、跨膜结构域和包括CD3ζ信号结构域和来自4-1BB的共刺激结构域的胞质结构域。4.根据权利要求1至3中任一项所述的CD123特异性嵌合抗原受体(123CAR)，其中，所述胞外配体结合结构域VH和VL是人源化的。5.根据权利要求1至4中任一项所述的CD123特异性嵌合抗原受体(123CAR)，其中，所述来自单克隆抗CD123抗体的胞外配体结合结构域VH和VL包含以下序列：XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXGFTFTDYYXXXXXXXXXXXXXXXXXIRSKADGYTTXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXARDAAYYSYYSPEGAMDYXXXXXXXXXXX(SEQ ID N°73)和/或XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXQNVDSAXXXXXXXXXXXXXXXXXSASXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXQQYYSTPWTXXXXXXXXX(SEQ ID N°74)，其中X是氨基酸。6.根据权利要求1至5中任一项所述的CD123特异性嵌合抗原受体(123CAR)，其中，所述来自单克隆抗CD123抗体的胞外配体结合结构域VH和VL包含以下序列的至少一种：(变体VH1：SEQ ID NO.60)：EVKLVESGGGLVQPGRSLRLSCTASGFTFTDYYMSWVRQAPGKGLEWVGLIRSKADGYTTEYSASVKGRFTISRDDSKSILYLQMNSLKTEDTAVYYCARDAAYYSYYSPEGAMDYWGQGTLVTVSS，(变体VH2：SEQ ID NO.61)：EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCTASGFTFTDYYMSWVRQAPGKGLEWVGLIRSKADGYTTEYSASVKGRFTISRDDSKSILYLQMNSLKTEDTAVYYCARDAAYYSYYSPEGAMDYWGQGTLVTVSS，(变体VH3：SEQ ID NO.62)：EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCTASGFTFTDYYMSWVRQAPGKGLEWVGLIRSKADGYTTEYSASVKGRFTISRDDSKSIAYLQMNSLKTEDTAVYYCARDAAYYSYYSPEGAMDYWGQGTLVTVSS，(变体VH4：SEQ ID NO.63)：EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCTASGFTFTDYYMSWVRQAPGKGLEWVGFIRSKADGYTTEYSASVKGRFTISRDDSKSIAYLQMNSLKTEDTAVYYCARDAAYYSYYSPEGAMDYWGQGTLVTVSS，(变体VH5：SEQ ID NO.64)：EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCTASGFTFTDYYMSWVRQAPGKGLEWVGFIRSKADGYTTEYAASVKGRFTISRDDSKSIAYLQMNSLKTEDTAVYYCARDAAYYSYYSPEGAMDYWGQGTLVTVSS，(变体VH6：SEQ ID NO.65)：EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCTASGFTFTDYYMSWVRQAPGKGLEWVGLIRSKADGYTTEYAASVKGRFTISRDDSKSIAYLQMNSLKTEDTAVYYCARDAAYYSYYSPEGAMDYWGQGTLVTVSS，(变体VH7：SEQ ID NO.66)；EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCTASGFTFTDYYMSWVRQAPGKGLEWVGFIRSKADGYTTEYAASVKGRFTISRDDSKSIAYLQMNSLKTEDTAVYYCTRDAAYYSYYSPEGAMDYWGQGTLVTVSS，(变体VL1：SEQ ID NO.54)：MADYKDIVMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQNVDSAVAWYQQKPGKAPKALIYSASYRYSGVPSRFSGRGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYSTPWTFGQGTKVEIKR，(变体VL2：SEQ ID NO.55)：MADYKDIQMTQSPSSVS...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗曼·加莱托，
申请(专利权)人：塞勒克提斯公司，
类型：发明
国别省市：法国;FR