具有肿瘤抑制作用的新型真核重组蛋白及其制备方法技术

本发明专利技术涉及一种具有肿瘤抑制作用的新型真核重组蛋白及其制备方法，属于医药生物工程领域，该具有肿瘤抑制作用的新型真核重组蛋白全长132个氨基酸，其中1～25为NLS序列，26～39为His‑FLAG标签序列，42～121为N240序列，122～132为TAT序列，His‑FLAG标签序列与N240序列之间用RS两个氨基酸进行连接；该具有肿瘤抑制作用的新型真核重组蛋白克服了现有技术中的小分子药物不能阻断TCF4与除β‑catenin外其他癌基因的结合导致不能有效抑制肿瘤干细胞的问题，从而能够全方位的阻断TCF4与原癌基因的结合，有效抑制肿瘤干细胞，促进化疗药物的敏感性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及医药生物工程领域，尤其涉及一种具有肿瘤抑制作用的新型真核重组蛋白及其制备方法。
技术介绍
近年来肿瘤干细胞(tumor stem cells，TSCs)学说越来越受到关注。目前已经成功在脑肿瘤、肺癌、肝癌、乳腺癌、前列腺癌、结直肠癌、皮肤癌等多种恶性肿瘤中成功分离出了肿瘤干细胞。肿瘤干细胞假说认为，经药物治疗后肿瘤复发和转移与肿瘤干细胞残存有密切关系。肿瘤干细胞的提出为肿瘤发生和复发机制提供了合理解释，对于研发更有效的抗肿瘤药物及干细胞和细胞生物学研究均具有重大意义。随着对TSCs研究的进一步深入，发现TSCs和正常干细胞有很多相似之处，如耐药、DNA修复活性和抗调亡等，TSCs的耐药特性帮助TSCs抵抗化疗药物的毒性作用，从而利于肿瘤增殖。Wnt信号通路是调控细胞生长、运动和分化的关键途径，Wnt信号通路在胚胎和器官发育以及维持干细胞的自我更新和防止细胞分化中起到至关重要的作用。近年研究表明，Wnt/β-catenin通路的不恰当激活，参与了肿瘤的发生、侵袭和转移，与肿瘤干细胞的关系尤为密切。在没有Wnt信号刺激时，细胞内新合成的β-catenin与APC、Axin、GSK-3β形成复合体相互作用，并促进β-catenin迅速被蛋白酶体降解，从而使β-catenin在胞质内保持低水平；在Wnt信号刺激下，Wnt蛋白可与细胞表面的FZ受体和LRP组成的复合体结合，促使细胞质中的Dsh聚集至细胞膜下，Dsh诱导GSK-3β磷酸化，使其与Axin脱离，阻断β-catenin的磷酸化和泛素化降解，使得大量游离的β-catenin在胞质聚集并进入细胞核，与TCF/LEF结合成复合体，激活靶基因的转录，包括原癌基因c-myc、cyclin D1、sox2等。正常干细胞通过不对称分裂使其一个子代细胞保持干细胞特性，而另一个子代细胞最终形成分化终末细胞。Wnt/β-catenin信号通路在维持干细胞池和防止细胞分化中起到至关重要的作用，它的这种作用是通过稳定胞质中β-catenin的水平来维持的。在人类癌症中，越来越多的证据表明肿瘤起源于干细胞的非对称分裂的失调。肿瘤干细胞与正常干细胞的区别在于其对称分裂特性。Wnt/β-catenin信号通路的调控失常是多种类型细胞发生癌变的主要原因之一。Wnt/β-catenin信号通路的异常激活的一个标志是β-catenin在细胞核内的高表达，这也被认为是肿瘤干细胞保持对称分裂的重要原因。最近研究显示，β-catenin在核内的高表达还赋予TSCs耐药和耐辐射损伤的能力。肿瘤细胞对化疗药物的耐药性是临床肿瘤治疗中的主要障碍，TSCs是造成肿瘤耐药的重要原因，因此针对TSCs的治疗将比针对整个肿瘤的治疗更为有效。针对Wnt/β-catenin信号通路中的重要信号分子的靶向治疗是一类具有发展前景的策略。细胞核中的β-catenin并不能独立发挥转录调控功能，必须与转录因子TCF4结合才能发挥对靶基因的转录。近年的研究证实肿瘤干细胞的存活和维持依赖于细胞核中β-catenin/TCF4的转录因子复合体的异常高表达。一种有效干预肿瘤干细胞的途径是破坏两者之间的相互结合。目前，已筛选出多个小分子化合物或多肽可阻断β-catenin与TCF4的相互结合，对肿瘤干细胞致瘤性有明显的抑制作用。目前，已知TCF4蛋白的N端80个氨基酸是β-catenin结合的关键结构域，同时该结构域还能结合多个致癌基因如ATF2、GRβ等。上述的小分子药物并不能阻断TCF4与除β-catenin的其他癌基因的结合。因此，如果单独表达TCF4的N端结构域多肽，使之作为内源性TCF4的竞争性抑制剂将更为有效阻止β-catenin/TCF4复合体的形成并抑制TCF/LEF转录调控功能，从而抑制肿瘤干细胞并促进化疗药物的敏感性。
技术实现思路
针对上述存在的问题，本专利技术提供一种具有肿瘤抑制作用的新型真核重组蛋白及其制备方法，以克服现有技术中的小分子药物不能阻断TCF4与除β-catenin的其他癌基因的结合导致不能有效抑制肿瘤干细胞的问题，从而能够全方位的阻断TCF4与原癌基因的结合，有效的抑制肿瘤干细胞，促进化疗药物的敏感性。为了实现上述目的，本专利技术采取的技术方案为：一种具有肿瘤抑制作用的新型真核重组蛋白，其中，将能与β-catenin结合的转录因子TCF4的氨基端(N端)的80个氨基酸序列命名为N240，在N240的N端连接核定位肽NLS，在N240的C端连接穿膜信号肽TAT，在NLS和N240之间加入His-FLAG标签，所述具有肿瘤抑制作用的新型真核重组蛋白功能区代号为：NLS-His-FLAG-N240-TAT；所述具有肿瘤抑制作用的新型真核重组蛋白全长132个氨基酸，其中1～25为NLS序列，26～39为His-FLAG标签序列，42～121为N240序列，122～132为TAT序列，所述His-FLAG标签序列与所述N240序列之间用RS两个氨基酸进行连接；所述具有肿瘤抑制作用的新型真核重组蛋白的氨基酸序列为：上述的具有肿瘤抑制作用的新型真核重组蛋白，其中，所述具有肿瘤抑制作用的新型真核重组蛋白对应的碱基序列为：一种如上述的具有肿瘤抑制作用的新型真核重组蛋白的制备方法，其中，包括：(1)NLS-His-FLAG-N240-TAT基因的克隆以pcDNA/Myc-TCF4载体为模板用高保真PCR扩增试剂盒扩增含TCF4前80个氨基酸的N240序列，在上下游引物中分别引入His-Flag序列和TAT序列，在N端引入NLS序列，得到初级PCR产物，以所述初级PCR产物为模板扩增最终的NLS-His-FLAG-N240-TAT序列，而后在最终的NLS-His-FLAG-N240-TAT序列两端分别引入内切酶Hind III和Kpn I酶切位点，得到PCR产物，用所述内切酶Hind III和Kpn I酶切所述PCR产物，再用胶回收试剂盒回收，得到PCR酶切产物；用所述内切酶Hind III和Kpn I酶切所述PCR产物，经1％琼脂糖凝胶电泳后用质粒抽提试剂盒回收，得到质粒酶切产物pcDNA3.1质粒；在温度为3～5℃的环境下采用T4DNA连接酶将所述PCR酶切产物和所述质粒酶切产物pcDNA3.1质粒连接过夜，而后转化至E.coli Dh5α感受态细胞后涂布到含50μg/ml氨苄青霉素的LB固体培养基上，在温度为36～38℃的环境下培养过夜；挑取单菌落，LB固体培养基过夜培养后通过PCR初筛阳性克隆、质粒抽提试剂盒抽提，得到阳性质粒：pcDNA3.1-NLS-His-FLAG-N240-TAT；(2)HEK293细胞的转染与表达将pcDNA3.1-NLS-His-FLAG-N240-TAT通过脂质体转染试剂转染HEK293细胞48小时后，加入新霉素进行加压筛选，构建表达NLS-His-FLAG-N240-TAT基因的HEK293稳转细胞株；(3)NLS-His-FLAG-N240-TAT重组蛋白的分离纯化对所述HEK293稳转细胞株进行扩大培养，而后收集细胞并抽提细胞总蛋白，蛋白抽提液用0.45μm的滤器过滤，使用Ni柱纯化带有His标签的重组蛋白；具体过程如下：转移树脂本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种具有肿瘤抑制作用的新型真核重组蛋白，其特征在于，将能与β‑catenin结合的转录因子TCF4的氨基端(N端)的80个氨基酸序列命名为N240，在N240的N端连接核定位肽NLS，在N240的C端连接穿膜信号肽TAT，在NLS和N240之间加入His‑FLAG标签，所述具有肿瘤抑制作用的新型真核重组蛋白功能区代号为：NLS‑His‑FLAG‑N240‑TAT；所述具有肿瘤抑制作用的新型真核重组蛋白全长132个氨基酸，其中1～25为NLS序列，26～39为His‑FLAG标签序列，42～121为N240序列，122～132为TAT序列，所述His‑FLAG标签序列与所述N240序列之间用RS两个氨基酸进行连接；所述具有肿瘤抑制作用的新型真核重组蛋白的氨基酸序列为：

【技术特征摘要】
1.一种具有肿瘤抑制作用的新型真核重组蛋白，其特征在于，将能与β-catenin结合的转录因子TCF4的氨基端(N端)的80个氨基酸序列命名为N240，在N240的N端连接核定位肽NLS，在N240的C端连接穿膜信号肽TAT，在NLS和N240之间加入His-FLAG标签，所述具有肿瘤抑制作用的新型真核重组蛋白功能区代号为：NLS-His-FLAG-N240-TAT；所述具有肿瘤抑制作用的新型真核重组蛋白全长132个氨基酸，其中1～25为NLS序列，26～39为His-FLAG标签序列，42～121为N240序列，122～132为TAT序列，所述His-FLAG标签序列与所述N240序列之间用RS两个氨基酸进行连接；所述具有肿瘤抑制作用的新型真核重组蛋白的氨基酸序列为：2.如权利要求1所述的具有肿瘤抑制作用的新型真核重组蛋白，其特征在于，所述具有肿瘤抑制作用的新型真核重组蛋白对应的碱基序列为：3.一种如权利要求1所述的具有肿瘤抑制作用的新型真核重组蛋白的制备方法，其特征在于，包括：(1)NLS-His-FLAG-N240-TAT基因的克隆以pcDNA/Myc-TCF4载体为模板用高保真PCR扩增试剂盒扩增含TCF4前80个氨基酸的N240序列，在上下游引物中分别引入His-Flag序列和TAT序列，在N端引入NLS序列，得到初级PCR产物，以所述初级PCR产物为模板扩增最终的NLS-His-FLAG-N240-TAT序列，而后在最终的NLS-His-FLAG-N240-TAT序列两端分别引入内切酶Hind III和Kpn I酶切位点，得到PCR产物，用所述内切酶Hind III和Kpn I酶切所述PCR产物，再用胶回收试剂盒回收，得到PCR酶切产物；用所述内切酶Hind III和Kpn I酶切所述PCR产物，经1％琼脂糖凝胶电泳后用质粒抽提试剂盒回收，得到质粒酶切产物pcDNA3.1质粒；在温度为3～5℃的环境下采用T4DNA连接酶将所述PCR酶切产物和所述质粒酶切产物pcDNA3.1质粒连接过夜，而后转化至E.coli Dh5α感受态细胞后涂布到含50μg/ml氨苄青霉素的LB固体培养基上，在温度为36～38℃的环境下培养过夜；挑取单菌落，LB固体培养基过夜培养后通过PCR初筛阳性克隆、质粒抽提试剂盒抽提，得到阳性质粒：pcDNA3.1-NLS-His-FLAG-N240-TAT；(2)HEK293细胞的转染与表达将pcDNA3.1-N...

【专利技术属性】
技术研发人员：邹健，殷莹，平锋锋，蒋孟军，陈越新，
申请(专利权)人：无锡市人民医院，
类型：发明
国别省市：江苏;32