本发明专利技术公开了一种用于防治阿尔茨海默病的融合蛋白及其制备方法和应用，该融合蛋白包括人p75NTR(p75神经营养因子受体)的胞外域p75NTR‑ECD、人IL‑33(白细胞介素‑33)以及分别连接所述p75NTR‑ECD的羧基端和所述人IL‑33的氨基端的连接肽；所述p75NTR‑ECD的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述人IL‑33的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。本发明专利技术克服了p75NTR‑ECD或其融合蛋白p75NTR‑ECD‑FC的不稳定和具有免疫原性和抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)的缺陷和防治AD的作用机理单一的缺点，同时将IL‑33和p75NTR‑ECD两者的功能结合在一起并通过提高两者的稳定性和协同作用大大提升防治AD的生物学活性。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物医学
，特别是涉及一种用于防治阿尔茨海默病的融合蛋白及其制备方法和应用。
技术介绍
阿尔茨海默病(Alzheimer's disease，AD)，常称“老年痴呆”症。自从20世纪发现阿尔茨海默病以来，AD发病率随着老龄化的加剧和相应的老年人口的快速增长而升高，AD的防治已成为各国政府和医学界关注的焦点。AD是一种起病隐匿的渐进性发展的神经系统退行性疾病，其确切的发病机理至今未明。AD的病因学说有多种，其中主要以β-淀粉样级联学说占主导地位。大脑出现包含淀粉样β肽(Aβ)淀粉斑的沉积是AD的主要组织病理学特征。淀粉斑的主要成分是Aβ，Aβ由39-43个氨基酸残基组成，而其中以Aβ40和Aβ42为主。Aβ来源于自其前体蛋白(Amyloid precursor protein，APP)，Aβ是APP分别经β-和γ-分泌酶(secretase)水解而成。在病理状态下，APP代谢异常，导致Aβ生成过多，或者由于Aβ清除障碍导致Aβ聚集、沉淀形成淀粉斑。神经营养因子受体p75(p75NTR)结合Aβ及其聚合体介导了β淀粉肽的神经毒性反应，诱导机体产生炎症反应，导致神经元病变和凋亡，促进AD的发生和病情进一步恶化。可溶性Aβ或其寡聚体和不溶性Aβ纤丝和斑块都有神经毒性作用。任何能防止大脑内Aβ的过度产生和聚集以及阻断p75NTR结合Aβ介导神经毒性反应的方法都可达到预防AD发生和缓解AD病情或阻止AD病情恶化的目的。p75NTR是p75神经营养因子受体，是相对分子质量为75kD的跨膜糖蛋白，由427个氨基酸组成，包含一条由28个氨基酸组成的信号肽、富集半胱氨酸的胞外域、疏水性的跨膜区以及由155个氨基酸组成的富含碱性氨基酸的胞内域。其胞外域(p75NTR extracellular domain，p75NTR-ECD)由4个半胱氨酸富集重复序列区(CRDs)组成，每个重复序列含有40个氨基酸组成的重复结构和6个半胱氨酸，翻译后经N-与O-糖基化修饰，第2个重复序列是结合神经营养因子(NTs)和Aβ所必需的。其跨膜区由含有22个氨基酸的单链组成，跟p75NTR的磷酸化有关。p75NTR被TACE(TNF-alpha converting enzyme)酶所裂解释放其胞外域p75NTR-ECD。根据游离的p75NTR-ECD可结合Aβ从而阻止p75NTR与Aβ结合产生神经毒性的原理，在中国专利ZL201010561284.3中，王延江和周新富设计p75NTR-ECD和p75NTR-ECD-FC用于AD的防治；在申请号为201210053808.7的中国专利申请中，王永堂等人设计p75NTR-ECD-FC用于促进损伤中枢神经再生与功能恢复。王延江和周新富以及王永堂等人设计和制备的p75NTR-ECD和p75NTR-ECD-FC存在以下缺陷；(1)他们都使用原核表达系制备目标蛋白，所制备的产物都未经过翻译后的糖基化修饰，因而未能保持p75NTR-ECD的原有的理化性质和蛋白质的天然空间构象，所以无法保证其制备的蛋白具有有效的生物活性用于AD的临床治疗。(2)p75NTR-ECD-FC是p75NTR-ECD与人免疫球蛋白的FC段的融合蛋白，其中的FC段能在体内诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)，导致自身的免疫系统攻击神经元细胞，促发AD或者促使AD进展和恶化，达不到防治AD的目的。(3)p75NTR-ECD-FC的FC段具有免疫原性，能诱导机体产生抗FC的抗体，促使ECD生物活性失效或者被快速降解。(4)p75NTR-ECD和p75NTR-ECD-FC只含ECD，只能和Aβ结合，未能诱导机体促进Aβ的降解，所以无法有效防治AD。白细胞介素-33(Interleukin-33,IL-33)是在2005年发现的白细胞介素-1(Interleukin-1，IL-1)家族的一个信号素，其基因序列与IL-1家族成员IL-1β和IL-18相似。IL-33是协调先天性免疫反应及免疫细胞浸润和活化的重要调节因子。IL-33含有270个氨基酸，包含一个N末端核定位信号、螺旋-转角-螺旋的基元和C端，分子量约18kDa。IL-33与由ST2和IL-1RAcP组成的异源二聚体受体复合物结合，触发包含髓样分化因子88(MyD88)和NF-κB的细胞内信号通道的级联反应，选择性地激活2型辅助性T细胞、肥大细胞，中性粒细胞，和选择性激活的巨噬细胞。在中枢神经系统(CNS)，IL-33由少突胶质细胞表达，而ST2则主要由小胶质细胞和星形胶质细胞表达。IL-33是一种多潜能、多效性的细胞因子，在感染、炎症和自身免疫性疾病中发挥着十分重要的调节作用。2009年，Chapuis J等人通过遗传学研究发现AD患者脑内的IL-33表达显著减少，且IL-33基因的三个单核苷酸多态性(SNPs)与降低AD的发生和进展的风险密切相关(参见“Chapuis J,et al.(2009)Transcriptomic and genetic studies identify IL-33as a candidate gene for Alzheimer’s disease.Mol Psychiatry 14(11):1004–1016.”)。2008年Miller,A.M.等人发现IL-33能对促进AD的发生和进展的重要危险因子动脉粥样硬化起到保护性作用(参见“Miller,A.M.,Xu,D.,Asquith,D.L.,Denby,L.,Li,Y.,Sattar,N.,Baker,A.H.,McInnes,I.B.,Liew,F.Y.,2008.IL-33reduces the development of atherosclerosis.J.Exp.Med.205,339246.”)。这种保护性作用可能与IL-33通过下调Aβ的分泌有关。2011年Yasuoka,S.等人发现IL-33能以呈剂量依赖性方式诱导小胶质细胞的增殖和细胞因子IL-1β、TNFα和IL-10的产生(参见“Yasuoka,S.,Kawanokuchi,J.,Parajuli,B.,Jin,S.,Doi,Y.,Noda,M.,Sonobe,Y.,Takeuchi,H.,Mizuno,T.,Suzumura,A.,2011.Production and functions of IL-33in the central nervous system.Brain Res.1385,8–17.”)。因此，研究发现IL-33能够防止AD的发生和阻止AD病情的进展和恶化，对AD防治具有潜在的治疗作用。鉴于目前还没有防治AD的有效药物和有效的治疗手段，以及p75NTR-ECD和p75NTR-ECD-FC在开发应用于AD防治方面存在缺陷，找到能够用于防治AD的有效药物至关重要。
技术实现思路
为了弥补上述现有技术的不足，本专利技术提出一种用于防治阿尔茨海默病的融合蛋白及其制备方法和应用。本专利技术的技术问题通过以下的技术方案予以解决：一种用于防治阿尔茨海默病的融合蛋白，包括人p75NTR的胞外域p75NTR-ECD、人IL-33以及分别连接所述p75NTR-ECD的羧基端和所述人IL本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于防治阿尔茨海默病的融合蛋白，其特征在于，包括人p75NTR的胞外域p75NTR‑ECD、人IL‑33以及分别连接所述p75NTR‑ECD的羧基端和所述人IL‑33的氨基端的连接肽；所述p75NTR‑ECD的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述人IL‑33的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
【技术特征摘要】
1.一种用于防治阿尔茨海默病的融合蛋白，其特征在于，包括人p75NTR的胞外域p75NTR-ECD、人IL-33以及分别连接所述p75NTR-ECD的羧基端和所述人IL-33的氨基端的连接肽；所述p75NTR-ECD的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述人IL-33的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。2.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于：所述连接肽为柔性连接肽，所述柔性连接肽的氨基酸序列为(Gly Gly Gly Gly Y)n，其中，n为1～6之间的整数，Y表示Ser或者Thr；优选地：所述连接肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；相应地，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。3.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于：所述连接肽为刚性连接肽，所述刚性连接肽为(Glu Ala Ala Ala Lys)m，其中，m为1～6之间的整数；或者所述刚性连接肽为富含脯氨酸序列(X Pro)q，其中q为3～10之间的整数，X为任意氨基酸，其中，X优选赖氨酸、丙氨酸或者谷氨酸中的任一种。4.一种权利要求1-3任意一项所述的融合蛋白的构建方法，其特征在于：包括将人p75NTR的细胞外域p75NTR-ECD的羧基端和人IL-33的氨基端通过连接肽连接起来的步骤，所述人p75NTR的细胞外域p75NTR-ECD的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述人IL-33的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。5.一种权利要求1-3任意一项所述的融合蛋白的表达载体，其特征在于：所述表达载体以mRNA，DNA质粒载体或病毒载体中的一种作为载体。6.一种权利要求1-3任意一项所述的融合蛋白的DNA质粒载体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)克隆得到人p75NTR的细胞外域p75NTR-ECD的基因片段；(2)克隆得到人IL-33的基因片段；(3)通过PCR反应得到编码p75NTR-ECD-Linker的基因片段，其中p75NTR-ECD的羧基端与Linker的氨基端连接，所述Linker的基因片段来自PCR反应的反向引物序列；(4)通过重叠PCR反应将p75NTR-ECD-Linker的羧基端与人IL-33的氨基端连接，获得融合蛋白p75NTR-ECD-IL-33的基因片段，其中，p75NTR-ECD-Linker基因片段的5’端带有一酶切位点，IL-33基因片段的3’端带有另一酶切位点；(5)将融合蛋白p75NTR-ECD-IL-33的基因片段通过酶切后插入一质粒载体中两个相应的酶切位点之间，转化宿主菌，提取阳性质粒，对插入的目的基因进行测...
【专利技术属性】
技术研发人员：麦俊波，
申请(专利权)人：深圳麦迪科生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44
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