阿尔茨海默病制造技术

本发明专利技术公开了β淀粉样蛋白(Aβ)的变异体形式和包含Aβ变异体的试剂盒。本发明专利技术还提供了这些试剂盒和Aβ变异体在Aβ研究中的用途，例如，用于筛选治疗阿尔茨海默病的新型化合物的试验和方法中。

Alzheimer disease

The invention discloses a variant form of beta amyloid protein (A beta) and a kit containing A beta variant. The present invention also provides the use of these kits and A beta variants in the study of A beta, for example, a test and a method for screening novel compounds for the treatment of Alzheimer's disease.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】本专利技术涉及阿尔茨海默病(AD)，特别(但不仅仅)涉及β淀粉样蛋白(Aβ或Abeta)及其变异体。本专利技术还包括包含Aβ变异体的试剂盒，以及这些试剂盒和Aβ变异体在Aβ研究中的用途，例如，用于筛选治疗AD的新型化合物的试验和方法。阿尔茨海默病(AD)的特征为大脑内细胞外淀粉样斑块中Aβ的沉积和细胞内神经纤维缠结中τ的积累。Aβ和淀粉样蛋白前体(APP)的突变与家族性AD有关，因此，Aβ被认为在疾病发生过程中起着重要的作用。为了更好地理解Aβ是如何参与AD患者的观察到的神经退化及该疾病的症状，人们进行了大量的研究。其中一些研究在转基因动物身上进行，而另一些则使用仿生膜、培养的神经元或动物注射液来研究在这些系统中寡聚态及纤维状Aβ的直接作用。Aβ有毒并且已被证明能够导致膜损伤、神经细胞死亡及影响功能(LTP)，同时还会改变动物的行为及神经网络。Aβ肽是淀粉生成肽和蛋白的更大群组的成员(1)，并且这些淀粉生成肽的毒性作用被认为与其形成β折叠丰富寡聚物和交叉β结构淀粉样纤维的自我聚集能力有关。重要的是，在Aβ的研究中所用的实验对照仅限于使用载体(即缓冲液)，乱序Aβ肽、反向Aβ以及两个截断的野生型Aβ(即Aβ40和Aβ1-28)。尽管这些肽对照为Aβ研究中的实验对照提供了一些方法，其中仍存在一个问题，即这些肽也可以聚集形成寡聚物或纤维，而现今的研究对它们的了解还十分有限。同样，尽管它们中的一部分大体上与野生型Aβ有相似的组成，但是它们在序列上仍然差异较大。因此，目前在Aβ研究中所用的Aβ对照肽并不理想。因此有必要寻找能够作为合适的阴性对照应用于Aβ研究中的替代Aβ肽，例如检测试剂盒。如示例中所述，专利技术人已设计出一种无毒性的Aβ变异体，所述Aβ变异体不具有聚集倾向，且其聚集情况、结构和毒性作用都非常明确，这为Aβ的研究提供了合适的对照肽。因此，根据第一方面提供了一种β-淀粉样蛋白(Aβ)肽变异体，所述变异体包含野生型Aβ肽的经修饰的氨基酸序列，其中所述经修饰的氨基酸肽与野生型肽相比，展现出降低的聚集倾向。出乎意料的是，专利技术人尝试根据第一方面，利用至少一个氨基酸的变化，惊人地将野生型肽从具有细胞毒性的强聚集性肽转化为在细胞试验中不能聚集或导致毒性的肽，从而得到了Aβ的变异体形式。就序列、PI、分子量以及其他化学特性而言，所述Aβ肽变异体与有毒的野生型Aβ相似，然而，重要的是，所述Aβ肽变异体经修饰而无法聚集形成β折叠结构。有利地，本专利技术中的Aβ变异体可作为鲁棒阴性对照验证Aβ的任何作用，例如，用于检测试剂盒中，或用于筛选治疗AD的新型化合物的试验中。此外，Aβ肽变异体还能用于鲁棒性试验来测定目标Aβ毒性或聚集的潜在治疗方法的功效。野生型Aβ(1-42)的氨基酸序列是已知的，可以如此处的SEQIDNo：1所示，如下：DAEFRHDSGYEVHHQEDVGSNKGAIIGLMV[SEQIDNo：1]因此，第一方面中的β-淀粉样蛋白(Aβ)肽变异体优选地包含源于野生型Aβ肽的经修饰的氨基酸序列，所述野生型Aβ肽包含大体上如SEQIDNo：1中所示的氨基酸序列。图1为使用WALTZ所作的图，显示了两个峰，所述两个峰表明在野生型Aβ(1-42)肽上有两个淀粉生成区域(即SEQIDNo：1中的氨基酸残基16-21和37-42，如上，它们用粗体表示且有下划线)。因此，本专利技术中的β-淀粉样蛋白(Aβ)肽变异体优选地在SEQIDNo：1中的16-21或37-42位氨基酸上有一个或多个修饰。优选地，所述β-淀粉样蛋白(Aβ)肽变异体在SEQIDNo：1中的16-21或37-42位氨基酸上有至少两个修饰。优选地，所述β-淀粉样蛋白(Aβ)肽变异体在SEQIDNo：1中的16-21位氨基酸上有至少一个修饰，并且在SEQIDNo：1中的37-42位氨基酸上有至少一个修饰。所述修饰或每个修饰优选地为取代。专利技术人测定了大量被引进野生型Aβ(1-42)两个淀粉生成区域的氨基酸取代，然后将能够减少淀粉生成区域峰的氨基酸取代列入并总结在表1中。基于他们的发现，专利技术人十分惊奇地观察到SEQIDNo：1中的残基19和37对于控制Aβ的毒性和聚集非常重要。因此，通过对SEQIDNo：1中的氨基酸残基F19或G37进行修饰，形成了β-淀粉样蛋白(Aβ)肽变异体的优选实施例。最优选地，β-淀粉样蛋白(Aβ)肽变异体通过对SEQIDNo：1中的氨基酸残基F19和G37进行修饰而形成。优选地，氨基酸残基F19包含被丝氨酸取代。因此，在一个优选的实施例中，β-淀粉样蛋白(Aβ)肽变异体包含大体上如SEQIDNo：2中所示的氨基酸序列，如下：DAEFRHDSGYEVHHQKLVFAEDVGSNKGAIIGLMVGVVIA[SEQIDNo：2]优选地，氨基酸残基G37的修饰包括被天冬氨酸取代。因此，在另一个优选实施例中，β-淀粉样蛋白(Aβ)肽变异体包含大体上如SEQIDNo：3中所示的氨基酸序列，如下：DAEFRHDSGYEVHHQKLVFAEDVGSNKGAIIGLMVGVVIA[SEQIDNo：3]优选地，β-淀粉样蛋白(Aβ)肽变异体包含F19S取代或G37D取代。然而，最优选的β-淀粉样蛋白(Aβ)肽变异体包含F19S取代和G37D取代。因此，优选地，β-淀粉样蛋白(Aβ)肽变异体包含大体上如SEQIDNo：4中所示的氨基酸序列，如下：DAEFRHDSGYEVHHQKLVFAEDVGSNKGAIIGLMVGVVIA[SEQIDNo：4]因此，优选地，β-淀粉样蛋白(Aβ)肽变异体包含基于SEQIDNo：1中野生型序列的双突变体。本专利技术还提供了核酸，其编码如本文所定义的β-淀粉样蛋白(Aβ)肽变异体实施例。因此，根据第一方面，本专利技术的第二方面提供了分离核酸分子，其编码β-淀粉样蛋白(Aβ)肽变异体。根据本专利技术的第二方面，优选的核酸分子可以包括：(a)F19S取代的β-淀粉样蛋白(Aβ)肽GATGCGGAATTTCGCCATGATAGCGGCTATGAAGTGCATCATCAGAAACTGGTGAGCTTTGCGGAAGATGTGGGCAGCAACAAAGGCGCGATTATTGGCCTGATGGTGGGCGGCGTGGTGATTGCG[SEQIDNo：5](b)G37D取代的β-淀粉样蛋白(Aβ)肽GATGCGGAATTTCGCCATGATAGCGGCTATGAAGTGCATCATCAGAAACTGGTGAGCTTTGCGGAAGATGTGGGCAGCAACAAAGGCGCGATTATTGGCCTGATGGTGGGCGGCGTGGTGATTGCG[SEQIDNo：6](c)F19S和G37D取代的β-淀粉样蛋白(Aβ)肽GATGCGGAATTTCGCCATGATAGCGGCTATGAAGTGCATCATCAGAAACTGGTGAGCTTTGCGGAAGATGTGGGCAGCAACAAAGGCGCGATTATTGGCCTGATGGTGGATGGCGTGGTGATTGCG[SEQIDNo：7]应用Backtranseq(www.ebi.ac.uk)及宿主大肠杆菌K12合成以上的核酸序列。因此，优选地，第二方面中，所述分离核酸分子包含大体上如SEQIDN本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种β‑淀粉样蛋白(Aβ)肽变异体，其包含野生型Aβ肽的经修饰的氨基酸序列，其中所述经修饰的氨基酸肽与所述野生型肽相比，展现出降低的聚集倾向。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.08.07 GB 1414038.81.一种β-淀粉样蛋白(Aβ)肽变异体，其包含野生型Aβ肽的经修饰的氨基酸序列，其中所述经修饰的氨基酸肽与所述野生型肽相比，展现出降低的聚集倾向。2.根据权利要求1所述的Aβ肽变异体，其中所述β-淀粉样蛋白(Aβ)肽变异体包含源于所述野生型Aβ肽的经修饰的氨基酸序列，其包含大体上如SEQIDNo：1中所示的氨基酸序列。3.根据权利要求1或2中任一权利要求所述的Aβ肽变异体，其中所述β-淀粉样蛋白(Aβ)肽变异体在SEQIDNo：1中的16-21或37-42位氨基酸上包含一个或多个修饰。4.根据以上任一权利要求所述的Aβ肽变异体，其中所述β-淀粉样蛋白(Aβ)肽变异体在SEQIDNo：1中的16-21或37-42位氨基酸上包含至少两个修饰。5.根据以上任一权利要求所述的Aβ肽变异体，其中所述β-淀粉样蛋白(Aβ)肽变异体在SEQIDNo：1中的16-21位氨基酸上包含至少一个修饰，并且在SEQIDNo：1中的37-42位氨基酸上包含至少一个修饰。6.根据以上任一权利要求所述的Aβ肽变异体，其中所述β-淀粉样蛋白(Aβ)肽变异体由SEQIDNo：1中的氨基酸残基F19或G37经修饰而形成。7.根据以上任一权利要求所述的Aβ肽变异体，其中所述β-淀粉样蛋白(Aβ)肽变异体由SEQIDNo：1中的氨基酸残基F19和G37经修饰而形成。8.根据权利要求2至7中任一权利要求所述的Aβ肽变异体，其中氨基酸残基F19的修饰包含被丝氨酸取代。9.根据权利要求8所述的Aβ肽变异体，其中所述β-淀粉样蛋白(Aβ)肽变异体包含大体上如SEQIDNo：2中所示的氨基酸序列。10.根据权利要求2至9中任一权利要求所述的Aβ肽变异体，其中氨基酸残基G37的修饰包含被天冬氨酸取代。11.根据权利要求10所述的Aβ肽变异体，其中所述β-淀粉样蛋白(Aβ)肽变异体包含大体上如SEQIDNo：3中所示的氨基酸序列。12.根据权利要求2至11中任一权利要求所述的Aβ肽变异体，其中所述β-淀粉样蛋白(Aβ)肽变异体包含F19S取代或G37D取代。13.根据权利要求2至12中任一权利要求所述的Aβ肽变异体，其中所述β-淀粉样蛋白(Aβ)肽变异体包含F19S取代和G37D取代。14.根据以上任一权利要求所述的Aβ肽变异体，其中所述β-淀粉样蛋白(Aβ)肽变异体包含大体上如SEQIDNo：4中所示的氨基酸序列。15.一种分离核酸分子，其编码根据权利要求1至14中任一权利要求所述的β-淀粉样蛋白(Aβ)肽变异体。16.根据权利要求15所述的分离核酸分子，其中所述分离核酸分子包含大体上如SEQIDNo：5-7中任一个所示的核苷酸序列或其功能性的变异体，优选地为SEQIDNo：7，或其功能性的变异体。17.一种基因构建体，其包含根据权利要求15或16中任一权利要求所述的核酸分子。18.一种重组载体，其包含根据权利要求17所述的基因构建体。19.一种宿主细胞，其包含根据权利要求17所述的基因构建体，或根据权利要求18所述的重...

【专利技术属性】
技术研发人员：L·C·瑟普尔，L·达哈尔，
申请(专利权)人：萨塞克斯大学，
类型：发明
国别省市：英国;GB