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【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及试剂盒,具体涉及一种检测生殖支原体的居家自检试剂盒。
技术介绍
1、生殖支原体是原核细胞型微生物,严重危害人群身心健康。可以引起多种疾病,如沙眼,还与人类泌尿生殖道疾病相关,如非淋菌性尿道炎、阴道炎、宫颈炎、子宫内膜炎等。生殖支原体感染与淋病是最常见的性传播疾病。由于筛查的力度不足,仍然存在着生殖支原体病例(特别是女性病例)发现不足的问题。
2、我国生殖支原体的实验室常规检测方法包括直接显微镜检查、分离培养及核酸检测。
3、关于核酸检测,目前国内大部分用的是荧光法。仁度生物的生殖支原体核酸检测试剂盒(rna恒温扩增)市场份额较大。该试剂盒基于实时荧光等温核酸扩增技术(sat)。首先,该试剂盒对阴道采样拭子来源的样品溶解于500μl生理盐水中,在取出400μl生理盐水进行核酸提取及纯化。通过m-mlv反转录酶产生靶标核酸(rna)的一个双链dna拷贝,然后利用t7 rna多聚酶从该dna拷贝上产生多个(100-1000个)rna拷贝;每一个rna拷贝再从反转录开始进入下一个扩增循环;同时,带有荧光标记的探针和这些rna拷贝特异结合,产生荧光。该荧光信号可由荧光检测仪器实时捕获,实时反映扩增循环情况。
4、达安基因的生殖支原体核酸定量检测试剂盒(pcr-荧光探针法)用一对生殖支原体特异性引物和一条生殖支原体特异性荧光探针,配以pcr反应液、耐热dna聚合酶(taq酶)、核苷酸(dntps)等成分,用pcr体外扩增法检测生殖支原体dna。
5、直接涂片法应用于眼部感染标本的
6、细胞培养法被公认是检测的金标准,但该方法敏感性受标本采集、储存、运输以及污染的影响较大,不同样本类型的敏感性差异较大。目前细胞培养法在诊断实验室很少被使用。
7、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(maldi-tof ms)是近年来发展起来的一种快速而强大的检测工具,广泛应用于病原微生物的鉴定,其检测原理是依据质荷比(m/z)的不同,提供微生物的蛋白质组指纹图谱,通过与已知微生物质谱峰比较,实现对微生物的快速鉴定。maldi-tof ms检测淋球菌单个反应成本较低、操作简单、检测迅速,但需要对培养后的菌落进行鉴定,检测的准确性依赖于数据库中菌种的信息量和可靠性,需要进一步完善其数据库并临床评估其准确性。
8、微生物的核酸检测(nucleic acid tests,nats)技术包括两种类型,直接nats检测和目标基因扩增技术(nucleic acid amplification tests,naats)。临床检测主要采用直接nats技术,其准确性高于直接免疫学检测方法。但直接nats技术的灵敏度远不如目标基因扩增技术(nucleic acid amplification tests,naats),其包括实时荧光pcr、转录介导扩增技术(transcription mediated amplifica-tion,tma)、链置换扩增(stranddisplacement amplifi-cation,sda)等检测方法。naats敏感性高,对泌尿生殖道标本的检测是较好的选择。
9、因核酸提取过程对仪器设备有较高要求,目前针对生殖支原体核酸进行检测的产品多针对实验室使用场景,还没有一款从取样到检测完全可居家完成的生殖支原体检测产品。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提出一种检测生殖支原体的居家自检试剂盒,具有高灵敏度、高特异性、高准确度、操作方法简单,用于生殖支原体的居家快速自检。
2、本专利技术的技术方案是这样实现的:
3、本专利技术提供一种检测生殖支原体的居家自检试剂盒,包括阴道自采样装置、样品保存液、等温扩增试剂、含有特殊标记的单链dna的信号放大系统、信号检测系统;所述信号检测系统包括含生殖支原体等温扩增引物对、crrna、关键酶、特殊抗体包被的侧流试纸条、阳性和阴性对照品。
4、(1)阴道自采样装置:采用市面上常用的阴道采样刷(非棉质),按照说明将采样刷送入阴道,旋转10-30s取样。
5、(2)样品保存液:将刷头浸入含500μl样品保存液的样品保存管,将细胞涮入样品保存液。该保存液为自己研发的温和dna裂解试剂,能实现样本dna有效裂解,且可实现等温扩增的直接扩增,无需dna纯化。
6、(3)等温扩增试剂:本试剂盒中等温扩增试剂为反应所需的各种蛋白,且为冻干粉末状态。反应时用50μl含有样本的样本保存液复溶冻干粉即可。
7、(4)信号方大体系:该体系的目的是对特异性扩增信号进行放大。利用生殖支原体扩增子特异性crrna靶向激活cas蛋白,进而激活其旁剪切效应。旁剪切效应通过剪切荧光探针的核酸序列、释放游离标签分子使信号放大。
8、(5)扩增信号检测体系:该体系通过侧流试纸条检测信号放大系统产生的游离分子标签实现扩增信号检测。
9、作为本专利技术的进一步改进,所述含生殖支原体等温扩增引物对对包括正向引物和反向引物,所述正向引物的核苷酸序列如seq id no.1所示;所述反向引物的核苷酸序列如seq id no2所示。
10、作为本专利技术的进一步改进,所述引物对的浓度分别为1-10μm,优选地,为5μm。
11、作为本专利技术的进一步改进,所述crrna的核苷酸序列如seq id no3所示,所述crrna的浓度为1-5μm,优选地,为2μm。
12、作为本专利技术的进一步改进,所述关键酶包括dna重组酶、单链结合蛋白、bst dna聚合酶,所述关键酶的三种组分以1:1:1的比例与上述引物制备成冻干粉。其中,bst dna聚合酶优选购自翌圣生物;dna重组酶购自美格生物;单链结合蛋白购自美格生物,引物由生工生物合成。
13、作为本专利技术的进一步改进,所述样本保存液包含:5-50mm ph值为7.0-9.0的tris-hcl溶液、10-30mm kcl、1-10mm mgcl2、10-50mm硫酸钠、0.5-5mm dntp、0.5-5mm rntp。
14、作为本专利技术的进一步改进,所述样本保存液包含:30mm ph值为8.0的tris-hcl溶液、20mm kcl、2mm mgcl2、20mm硫酸钠、2mm dntp、2mm rntp。
15、作为本专利技术的进一步改进,所述含有特殊标记的单链dna作为信号放大体系包含cas12a酶及crrna,两者制备成冻干粉,其中,含有特殊标记的单链dna的核苷酸序列如seqid no.4所示,含有特殊标记的单链dna的5’端标记fam基团,3’端标记biotin。
16、作为本专利技术的进一步改进,所述特殊抗体包被的侧流试纸条含有anti-biotin、anti-fam两条标记线。
17、作为本专利技术的进一步改进,所述阳性和阴性对照品中,阳性对照品为含有生殖支原体16s本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种检测生殖支原体的居家自检试剂盒,其特征在于,包括阴道自采样装置、样品保存液、等温扩增试剂、含有特殊标记的单链DNA的信号放大系统、信号检测系统;所述信号检测系统包括含生殖支原体等温扩增引物对、CrRNA、关键酶、特殊抗体包被的侧流试纸条、阳性和阴性对照品。
2.根据权利要求1所述检测生殖支原体的居家自检试剂盒,其特征在于,所述含生殖支原体等温扩增引物对对包括正向引物和反向引物,所述正向引物的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示;所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO2所示。
3.根据权利要求2所述检测生殖支原体的居家自检试剂盒,其特征在于,所述引物对的浓度分别为1-10μM,优选地,为5μM。
4.根据权利要求1所述检测生殖支原体的居家自检试剂盒,其特征在于,所述CrRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO3所示,所述CrRNA的浓度为1-5μM,优选地,为2μM。
5.根据权利要求1所述检测生殖支原体的居家自检试剂盒,其特征在于,所述关键酶包括DNA重组酶、单链结合蛋白、Bst DNA聚合酶,所述关键酶的三种组分以1:
6.根据权利要求1所述检测生殖支原体的居家自检试剂盒,其特征在于,所述样本保存液包含:5-50mM pH值为7.0-9.0的Tris-HCl溶液、10-30mM KCl、1-10mM MgCl2、10-50mM硫酸钠、0.5-5mM dNTP、0.5-5mM rNTP。
7.根据权利要求1所述检测生殖支原体的居家自检试剂盒,其特征在于,所述样本保存液包含:30mM pH值为8.0的Tris-HCl溶液、20mM KCl、2mM MgCl2、20mM硫酸钠、2mM dNTP、2mM rNTP。
8.根据权利要求1所述检测生殖支原体的居家自检试剂盒,其特征在于,所述含有特殊标记的单链DNA作为信号放大体系包含Cas12a酶及crRNA,两者制备成冻干粉,其中,含有特殊标记的单链DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示,含有特殊标记的单链DNA的5’端标记FAM基团,3’端标记Biotin。
9.根据权利要求1所述检测生殖支原体的居家自检试剂盒,其特征在于,所述特殊抗体包被的侧流试纸条含有anti-Biotin、anti-FAM两条标记线。
10.根据权利要求1所述检测生殖支原体的居家自检试剂盒,其特征在于,所述阳性和阴性对照品中,阳性对照品为含有生殖支原体16S rRNA基因区域特异性靶标DNA片段的质粒溶液;所述质粒溶液浓度为106拷贝/mL;所述阴性对照品为清水;所述含有生殖支原体16S rRNA基因区域特异性靶标DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
...【技术特征摘要】
1.一种检测生殖支原体的居家自检试剂盒,其特征在于,包括阴道自采样装置、样品保存液、等温扩增试剂、含有特殊标记的单链dna的信号放大系统、信号检测系统;所述信号检测系统包括含生殖支原体等温扩增引物对、crrna、关键酶、特殊抗体包被的侧流试纸条、阳性和阴性对照品。
2.根据权利要求1所述检测生殖支原体的居家自检试剂盒,其特征在于,所述含生殖支原体等温扩增引物对对包括正向引物和反向引物,所述正向引物的核苷酸序列如seq idno.1所示;所述反向引物的核苷酸序列如seq id no2所示。
3.根据权利要求2所述检测生殖支原体的居家自检试剂盒,其特征在于,所述引物对的浓度分别为1-10μm,优选地,为5μm。
4.根据权利要求1所述检测生殖支原体的居家自检试剂盒,其特征在于,所述crrna的核苷酸序列如seq id no3所示,所述crrna的浓度为1-5μm,优选地,为2μm。
5.根据权利要求1所述检测生殖支原体的居家自检试剂盒,其特征在于,所述关键酶包括dna重组酶、单链结合蛋白、bst dna聚合酶,所述关键酶的三种组分以1:1:1的比例与上述引物制备成冻干粉。
6.根据权利要求1所述检测生殖支原体的居家自检试剂盒,其特征在于,所述样本保存液包含:5-50mm ph值为7.0-9.0的tris-hcl溶液、1...
【专利技术属性】
技术研发人员:陈世民,何良,李惠,周虎,王志杰,胡婷,
申请(专利权)人:武汉凯德维斯生物技术有限公司,
类型:发明
国别省市:
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