【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物学领域，涉及一种重组腺病毒和溶瘤病毒组合物及其应用,具体涉及一种携带pd-l1 shrna的复制缺陷型腺病毒与能在肿瘤组织中特异性复制的溶瘤腺病毒的组合物及其应用。
技术介绍
1、癌症是全球仅次于心血管疾病的第二大死亡原因，有研究统计，2020年全球有1930万新癌症病例和1000万癌症相关死亡病例。其中肝癌，胃癌，食道癌和肺癌是全世界范围内发病率较高的癌症，其中胃癌死亡率高达70％，其主要治疗手段包括手术治疗、放射治疗、化学药物治疗和靶向治疗。但是由于癌细胞的转移、复发、异质性及其对化疗和放疗的抗性，许多传统的治疗方法对其无效，每年仍有数百万患者因癌症而死亡。因此基因治疗等许多新型治疗手段的出现，为提高癌症患者的生存率带来了希望。基因治疗主要包括基因增补、基因沉默、溶瘤病毒疗法和基因编辑技术等。相比于其它治疗方法，溶瘤病毒疗法具有较好的靶向性和抗癌潜能，为肿瘤的治疗提供了新的方向。
2、溶瘤病毒疗法是一种革命性的癌症治疗工具，溶瘤病毒载体是指一类天然的或经过基因改造后可特异性攻击和破坏癌细胞、而对正常细胞损伤较小的基因治疗载体药物。其主要通过在肿瘤细胞选择性复制裂解肿瘤细胞和诱导全身抗肿瘤免疫反应的双重作用机制实现抗肿瘤效果。其主要包括新城疫病毒、单纯疱疹病毒、呼肠孤病毒和溶瘤腺病毒。溶瘤腺病毒具有明显的组织趋向性和感染多种分裂和非分裂细胞的能力，属于研究最深入的病毒载体，被应用于基因治疗和溶瘤作用。溶瘤腺病毒的优势主要包括以下几点，首先是杀伤效率高，靶向性好，多种杀伤肿瘤途径，基因组较小，易于改
3、我国是世界上很早开始溶瘤病毒研究的国家之一。2005年，安柯瑞在国内被批准上市，其应用溶瘤腺病毒作为载体治疗晚期鼻咽癌，从而使中国成为世界上首个批准将溶瘤病毒正式用于恶性肿瘤临床治疗的国家。2015年，用于治疗晚期黑色素瘤的重组单纯孢疹病毒药物t-vec获得美国fda的批准，这标志着溶瘤病毒疗法技术逐渐成熟。虽然最近几年应用溶瘤病毒治疗肿瘤的临床试验越来越多，但是同其他治疗方法一样，溶瘤病毒的治疗也存在一定的局限性，如其在肿瘤组织中的低渗透率,体内存在中和抗体等。
4、与此同时，另一种治疗策略如调节免疫检查点的表达在治疗癌症方面也具有很好的前景。细胞程序性死亡配体1(programmed cell death ligand 1,pd-l1)是一种免疫检查点蛋白，通过与细胞程序性死亡受体1(programmed cell death protein 1,pd-1)的结合来调节免疫反应。pd-l1在许多癌症细胞中表达。pd-l1与免疫细胞上的pd-1相互作用，通过抑制t细胞活性和增殖、促进t细胞耗竭以及诱导活化的t细胞凋亡来帮助肿瘤细胞逃避免疫系统的杀伤。因此，阻断pd-1与pd-l1的相互作用已经成为增强多种恶性肿瘤抗肿瘤免疫的有效治疗策略。近几年来，免疫检查点抑制剂pd-1和pd-l1抗体药的成功研发，显着改善了黑色素瘤、非小细胞肺癌、霍奇金淋巴瘤和胃癌等恶性肿瘤患者的临床结果，使得恶性肿瘤治疗的有效性达到了20％左右。这虽然是癌症治疗领域一个巨大的进步，然而，仍然有绝大部分癌症患者对免疫检查点抑制剂药物不起作用，这表明关于pd-l1在癌症中的功能可能还有更多需要去了解和探索。
技术实现思路
1、针对现有技术的上述不足，本专利技术的目的是提供一种携带pd-l1 shrna的重组腺病毒。
2、本专利技术的另一目的是提供由所述重组腺病毒与可以在肿瘤组织中特异性复制的溶瘤腺病毒的组合物。
3、本专利技术的又一目的是提供非疾病治疗目的的抑制肿瘤细胞生长的方法。
4、本专利技术的目的可通过以下技术方案实现：
5、一种敲低pd-l1表达的shrna，其特征在于，序列如seq id no.1-seq id no.5中任一项所示。
6、
7、
8、其中seq id no.6为无敲低pd-l1表达功能的shrna。
9、一种敲低pd-l1表达的腺病毒质粒，含有本专利技术所述的shrna序列。
10、作为本专利技术的一种优选，所述腺病毒质粒的出发质粒为pdc316-zsgreen-shrna。
11、一种重组腺病毒，所述腺病毒为含有本专利技术所述的敲低pd-l1表达的shrna或者包含本专利技术所述的腺病毒质粒。
12、作为本专利技术的一种优选，所述腺病毒为人类复制缺陷型腺病毒。
13、本专利技术所述的shrna、本专利技术所述的腺病毒质粒、本专利技术所述的重组腺病毒在制备治疗癌症的药物中的应用。
14、作为本专利技术的一种优选，所述的癌症选自胃癌、结肠癌，优选胃癌。
15、一种组合物，含有本专利技术所述的重组腺病毒和溶瘤病毒。
16、作为本专利技术的一种优选，所述的溶瘤病毒为含有肿瘤特异性启动子htert和复制必须蛋白e1a的重组溶瘤病毒。
17、作为本专利技术的一种优选，所述溶瘤腺病毒为人类复制型腺病毒。
18、本专利技术所述的组合物在制备抑制肿瘤细胞的试剂和/或治疗癌症的药物中的应用。
19、作为本专利技术的一种优选，所述肿瘤细胞为胃腺癌细胞或结肠癌细胞；优选的，所述胃腺癌细胞为sgc-7901和mgc-803；所述结肠癌细胞为hct116。
20、作为本专利技术的一种优选，所述癌症为胃癌或结肠癌，优选胃癌。
21、一种抑制肿瘤细胞生长的方法，首先将本专利技术所述的腺病毒质粒导入肿瘤细胞中，联合应用所述的重组溶瘤病毒，以抑制肿瘤细胞生长。
22、一种抑制肿瘤细胞生长的方法将本专利技术所述的组合物共同转染肿瘤细胞，通过所述的重组腺病毒降低肿瘤细胞中pd-l1的表达水平，提高所述的溶瘤病毒rcad对肿瘤生长的抑制作用。
23、有益效果
24、本专利技术提供的一种携带pd-l1 shrna的重组腺病毒与溶瘤腺病毒联合应用，与现有技术相比，具有以下有益效果：
25、(1)本方法应用的重组腺病毒与溶瘤腺病毒联合应用能明显抑制肿瘤的生长；
26、(2)应用本方法治疗之后肿瘤组织中的pd-l1被明显敲低且e1a表达明显增强；
27、(3)由于e1a可以由来自癌症特异性或选择性表达的5’端调节序列基因驱动，例如人端粒酶逆转录酶(human telomere reverse-transcriptase,htert)启动子，而且许多研究表明，绝大多数恶性肿瘤表达端粒酶蛋白，而大多数正常细胞则不表达，所以其可以启动e1a选择性表达使病毒在人肿瘤细胞中特异性复制进而产生溶瘤作用，所以应用本方法治疗之后肿瘤组织中免疫反应明显增强且本方法治疗具有极强的安全性。
28、(4)与将pd-l1 shrna整合至溶瘤病毒基因组中的实验组相比，携带pd-l1的腺病毒rdad-shrna与溶瘤病毒rcad联合使用对肿瘤的抑制作用显著增强，如图所示，这可能是由于整合了s本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种敲低PD-L1表达的shRNA，其特征在于，序列如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.5中任一项所示。
2.一种敲低PD-L1表达的腺病毒质粒，其特征在于含有权利要求1所述的shRNA序列。
3.根据权利要求2所述的腺病毒质粒，其特征在于，所述腺病毒质粒的出发质粒为PDC316-zsGreen-shRNA。
4.一种重组腺病毒，其特征在于，所述腺病毒为含有权利要求1所述的敲低PD-L1表达的shRNA基因片段或者包含权利要求2或3所述的腺病毒质粒。
5.根据权利要求4所述的重组腺病毒，其特征在于，所述腺病毒为人类复制缺陷型腺病毒。
6.权利要求1所述的shRNA、权利要求2或3所述的腺病毒质粒、权利要求4或5所述的重组腺病毒在制备治疗癌症的药物中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于所述的癌症选自胃癌、结肠癌，优选胃癌。
8.一种组合物，其特征在于含有权利要求4或5所述的重组腺病毒和溶瘤病毒。
9.根据权利要求8所述的组合物，其特征在于所述的溶瘤病毒为含有肿
10.根据权利要求8所述的组合物，其特征在于，所述溶瘤腺病毒为人类复制型腺病毒。
11.权利要求8-10中任一项所述的组合物在制备抑制肿瘤细胞的试剂和/或治疗癌症的药物中的应用。
12.根据权利要求11所述的应用，其特征在于，所述肿瘤细胞为胃腺癌细胞或结肠癌细胞；优选的，所述胃腺癌细胞为SGC-7901和MGC-803；所述结肠癌细胞为HCT116。
13.根据权利要求11所述的应用，其特征在于，所述癌症为胃癌或结肠癌，优选胃癌。
14.一种抑制肿瘤细胞生长的方法，其特征在于，首先将权利要求4或5所述的重组腺病毒导入肿瘤细胞中，联合应用权利要求9中所述的重组溶瘤病毒，以抑制肿瘤细胞生长。
15.一种抑制肿瘤细胞生长的方法，其特征在于，将权利要求8-10中任一项所述的组合物共同转染肿瘤细胞，通过权利要求4或5所述的重组腺病毒降低肿瘤细胞中PD-L1的表达水平，提高所述的溶瘤病毒RCAd对肿瘤生长的抑制作用。
...【技术特征摘要】
1.一种敲低pd-l1表达的shrna，其特征在于，序列如seq id no.1-seq id no.5中任一项所示。
2.一种敲低pd-l1表达的腺病毒质粒，其特征在于含有权利要求1所述的shrna序列。
3.根据权利要求2所述的腺病毒质粒，其特征在于，所述腺病毒质粒的出发质粒为pdc316-zsgreen-shrna。
4.一种重组腺病毒，其特征在于，所述腺病毒为含有权利要求1所述的敲低pd-l1表达的shrna基因片段或者包含权利要求2或3所述的腺病毒质粒。
5.根据权利要求4所述的重组腺病毒，其特征在于，所述腺病毒为人类复制缺陷型腺病毒。
6.权利要求1所述的shrna、权利要求2或3所述的腺病毒质粒、权利要求4或5所述的重组腺病毒在制备治疗癌症的药物中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于所述的癌症选自胃癌、结肠癌，优选胃癌。
8.一种组合物，其特征在于含有权利要求4或5所述的重组腺病毒和溶瘤病毒。
9.根据权利要求8所述的组合物，其特征在于...
【专利技术属性】
技术研发人员：罗光佐，孙冬，
申请(专利权)人：南京贝思奥生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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