【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
【】本专利申请要求于2021年07月26日向韩国专利厅提交的韩国专利申请第10-2021-0097954号的优先权，所述专利申请的公开内容以引用方式并入本说明书。本专利技术涉及一种用于小球藻(chlorella vulgaris)转化(transformation)的载体(vector)系统、使用其的小球藻转化方法及小球藻转化体。
技术介绍
0、
技术介绍
1、小球藻(chlorella vulgaris)是属于绿藻门(chlorophyta phylum)的单细胞微藻类。由于小球藻具有光合作用机制，在进行光合作用的同时，仅靠光、二氧化碳、水和少量矿物质就可以快速生长，因此被广泛用于大量生产(photobioreactor)有用物质的研究。
2、此外，由于生物质(biomass)的糖脂(glycolipid)含量较高，约为42％，因此，也广泛用于可用作生物柴油替代品的生物燃料的开发研究。近来，据一项研究发表，可以使用小球藻去除作为放射性同位素的锶-90(90sr)。
3、使用潮霉素b抗性基因(hygromycin b resistance gene)、腐草霉素d1(zeocin)抗性基因(zeocin resistance gene)、氯霉素乙酰转移酶基因(chloramphenicolacetyltransferase gene，catgene)等作为选择标记，进行电穿孔(electroporation)的结果，虽然插入(整合(integration))到了染色体dna中，但仅短暂产生了转
4、作为转化(transformation)方法包括玻璃珠(glass beads)、电穿孔及农杆菌介导(agrobacterium-mediated)转化(transformation)方法等，然而由于缺乏有效的选择标记(selectable marker)和转化系统(transformation system)，因此小球藻的使用实际上受到了限制。
5、随着技术的发展，电力使用量剧增，能源消费和生产效率性也在增加。为适应随着电力的使用量急剧增加及根据其的生产效率性，全世界都在关注利用核电站的电力生产。伴随着其生产效率性，始终出现的问题就是核电站事故和污染水中的放射性污染及基于金属离子的污染所带来的风险。
6、此外，还面临着在工业现场使用的稀有金属锶(sr)、铯(cs)、锂(li)等依赖海外进口的国家性问题，随着二次电池市场的增大，这些问题更加突出，因此对其的再利用问题正在成为行业性以及国家性的重大问题。
技术实现思路
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技术实现思路
1、【本专利技术要解决的技术问题】
2、因此，本专利技术人为开发出小球藻(chlorella vulgaris)的转化方法而付出不懈努力的结果，通过预测coccomyxa c-169(以下简称为c-169，过去被称为小球藻，但已更名)的启动子(promotor)和终止子(terminator)部位而获得序列，并与sh ble基因融合(fusion)而完成了合成。轮枝链霉菌博来霉素(streptomyces verticillus bleomycin，sh ble)基因的中间没有插入任何内含子，并且通过用swai/kpni限制性内切酶处理已合成的dna片段(fragment)，将其克隆到psp124s载体，并将其命名为pka650。
3、此外，在pka650载体中，将作为目的基因的β型碳酸酐酶(beta-type carbonicanhydrase)克隆到轮枝链霉菌博来霉素(streptomyces verticillus bleomycin，sh ble)基因的中间，并将其命名为pjg002。
4、接下来，通过金粒子轰击法(gold particle bombardment)转化后，在包含腐草霉素d1(zeocin)的培养基中培养，以进行选择性筛选。通过筛选和培养获得菌落(colony)来制造出转化体，从而完成了本专利技术。
5、因此，本专利技术的目的在于提供用于小球藻转化的载体系统。
6、本专利技术的另一个目的在于提供小球藻的转化方法。
7、本专利技术的另一个目的在于提供小球藻转化体。
8、【技术方案】
9、本专利技术涉及一种用于小球藻(chlorella vulgaris)转化的载体系统、使用其的小球藻转化方法及微藻类转化体。
10、以下，将进一步详细说明本专利技术。
11、本专利技术的一个方面涉及一种用于小球藻(chlorella vulgaris)转化的载体系统，所述载体系统包括：
12、coccomyxa c-169核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基2(coccomyxa c-169ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase(rubisco)small subunit 2(rbcs2))基因的启动子；
13、目的蛋白质-编码核苷酸(nucleotide)序列；以及
14、coccomyxa c-169rbcs2基因的终止子序列。
15、在本专利技术中，启动子可以包含seq id no.2的碱基序列，或者可以包含与所述seqid no.2的碱基序列具有实质同一性的碱基序列，例如，可以由seq id no.2的碱基序列组成，但不限于此。
16、在本专利技术的一个例子中，包含seq id no.2的碱基序列的启动子可以是在seq idno.1中所包含的seq id no.2的序列的3’末端还包含1至50bp的碱基的序列，但不限于此。
17、在本专利技术中，终止子序列可以包含seq id no.3的碱基序列，或者可以包含与所述seq id no.3的碱基序列具有实质同一性的碱基序列，例如，可以由seq id no.3的碱基序列组成，但不限于此。
18、在本专利技术中，目的蛋白质-编码核苷酸序列可以可操作地连接(operativelylinked)到启动子。
19、在本专利技术中，术语“可操作地连接(operatively linked)”是指核酸表达调控序列(例如，启动子序列、信号序列或者转录因子结合位点的陈列(array))与另一核酸序列之间的功能性结合，由此所述调控序列调节所述另一核酸序列的转录和/或翻译。
20、在本专利技术中，目的蛋白质-编码核苷酸序列可以连接在终止子序列的3’末端，但不限于此。
21、在本专利技术中，载体系统还可以包括选择标记。
22、在本专利技术中，选择标记可以是抗生素抗性基因，但不限于此。
23、在本专利技术中，抗生素可以是选自由奇霉素(spectinomycin)、巴龙霉素(paromomycin)、氨苄西林(ampicillin)、腐草霉素d1(zeocin)及博来霉素(b本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于小球藻(Chlorella vulgaris)转化的生物矿化载体，其特征在于，包括：
2.根据权利要求1所述的生物矿化载体，其特征在于，所述启动子包含SEQ ID NO.2的碱基序列。
3.根据权利要求1所述的生物矿化载体，其特征在于，所述目的蛋白质-编码核苷酸序列可操作地连接(operatively linked)到启动子。
4.根据权利要求1所述的生物矿化载体，其特征在于，所述终止子序列包含SEQ IDNO.3的碱基序列。
5.根据权利要求1所述的生物矿化载体，其特征在于，所述载体还包含抗生素抗性基因作为选择标记。
6.根据权利要求5所述的生物矿化载体，其特征在于，所述抗生素是选自由奇霉素、巴龙霉素、氨苄西林、腐草霉素D1及博来霉素组成的组中的1种以上。
7.根据权利要求1所述的生物矿化载体，其特征在于，所述载体还包含编码报告分子的基因。
8.根据权利要求7所述的生物矿化载体，其特征在于，所述报告分子是选自由生长刺激蛋白、荧光蛋白及水解酶组成的组中的1种以上。
9.根据
10.根据权利要求7所述的生物矿化载体，其特征在于，所述水解酶为β-葡萄糖醛酸酶。
11.根据权利要求1所述的载体，其特征在于，所述载体用于使用金粒子轰击法(goldparticles bombardment)的微藻类转化。
12.一种小球藻(Chlorella vulgaris)，其特征在于，所述权利要求1至11中任意一项所述的载体进行转化。
...【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种用于小球藻(chlorella vulgaris)转化的生物矿化载体，其特征在于，包括：
2.根据权利要求1所述的生物矿化载体，其特征在于，所述启动子包含seq id no.2的碱基序列。
3.根据权利要求1所述的生物矿化载体，其特征在于，所述目的蛋白质-编码核苷酸序列可操作地连接(operatively linked)到启动子。
4.根据权利要求1所述的生物矿化载体，其特征在于，所述终止子序列包含seq idno.3的碱基序列。
5.根据权利要求1所述的生物矿化载体，其特征在于，所述载体还包含抗生素抗性基因作为选择标记。
6.根据权利要求5所述的生物矿化载体，其特征在于，所述抗生素是选自由奇霉素、巴龙霉素、氨苄西林、腐草霉素d1及博来霉素组成的...
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