一种融合基因BFNA、重组腺病毒及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种融合基因BFNA、重组腺病毒及其制备方法和应用，属于基因工程技术领域，所述融合基因BFNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述的融合基因BFNA的制备方法，包括以下步骤：1)分别以包括BZLF1基因和包括EBNA1基因的cDNA为模板进行PCR扩增，获得带有粘性末端的BZLF1基因片段和带有粘性末端的EBNA1基因片段；2)以所述带有粘性末端的BZLF1基因片段和带有粘性末端的EBNA1基因片段为模板进行重叠延伸PCR扩增获得融合基因。本发明专利技术中，所述重组腺病毒包括所述融合基因，对于肿瘤具有显著的抑制作用，能够延长成瘤时间，抑瘤率达到82％以上。

【技术实现步骤摘要】
一种融合基因BFNA、重组腺病毒及其制备方法和应用
本专利技术属于基因工程
，尤其涉及一种融合基因BFNA、重组腺病毒及其制备方法和应用。
技术介绍
研究表明，EB病毒(Epstein-barrvirus，EBV)的感染与鼻咽癌、胃癌的发生关系密切。EB病毒感染宿主细胞包括潜伏期和裂解期，在EB病毒阳性肿瘤细胞中，病毒一般处于潜伏期，其潜伏存在及其DNA与宿主细胞整合是导致肿瘤细胞发生的重要原因，人工诱导病毒由潜伏期进入裂解期，导致肿瘤细胞裂解死亡，有望成为治疗EB病毒相关肿瘤的新手段和新方法。即刻早期基因(BZLF1)所编码的蛋白是一种转录激活因子，BZLF1的表达可诱导病毒从潜伏期进入裂解期，将BZLF1重组后，感染EBV阳性肿瘤细胞，可以诱导肿瘤细胞中处于潜伏期的EB病毒进入裂解期，并开启病毒复制机制，导致EB病毒阳性肿瘤细胞裂解死亡，达到特异性杀伤肿瘤细胞的作用。在鼻咽癌细胞中，EBV以Ⅱ型隐性感染状态存在，主要表达EBNA1、LMP1和LMP2(见图1)。EBNA1(EBnuclearantigen1,EBNA1)是唯一在所有EBV相关肿瘤中均表达的蛋白，当病毒潜伏感染时，EBNA1在基因组的维持、复制和转录过程中发挥重要作用。另外，2016年，Noh等(NohK.W,ParkJ,KangMS.TargeteddisruptionofEBNA1inEBV-infectedcellsattenuatedcellgrowth[J].BMBRep,2016,49(4):226-231.)研究以EBNA1为靶点，利用转录激活诱导剂E1TN诱导EBNA1基因表达，结果表明，E1TN诱导法能诱导EBV阳性的B淋巴细胞逐渐凋亡，而EBV阴性细胞未受到任何影响，该方法为EBV相关肿瘤治疗提供了新思路。但是目前缺乏高效的治疗手段。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于一种融合基因BFNA、重组腺病毒及其制备方法和应用；所述融合基因是将去除重复结构域的EBNA1基因与去除庸余序列的BZLF1基因进行融合获得；包括所述融合基因BFNA的重组腺病毒能够显著的抑制肿瘤，提高机体中CD4+T和CD8+T等免疫细胞的含量。本专利技术提供了一种融合基因BFNA，所述融合基因BFNA的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。本专利技术提供了所述的融合基因BFNA的制备方法，包括以下步骤：1)分别以包括BZLF1基因和包括EBNA1基因的cDNA为模板进行PCR扩增，获得带有粘性末端的BZLF1基因片段和带有粘性末端的EBNA1基因片段；2)以所述带有粘性末端的BZLF1基因片段和带有粘性末端的EBNA1基因片段为模板进行重叠延伸PCR扩增获得融合基因；步骤1)中扩增BZLF1基因的引物包括F1和F2，所述F1的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示；所述F2的核苷酸序列如SEQIDNo.3所示；步骤1)中扩增EBNA1基因的引物包括F3和F4，所述F3的核苷酸序列如SEQIDNo.4所示；所述F4的核苷酸序列如SEQIDNo.5所示；步骤2)中扩增获得融合基因的引物包括F1和F4。优选的，所述包括BZLF1基因和包括EBNA1基因的cDNA来源于B95-8EB病毒阳性细胞。优选的，步骤2)中所述重叠延伸PCR的程序包括以下步骤：95℃预变性3min；95℃变性40s，55℃退火40s，72℃延伸1min，共40个循环，最后72℃延伸6min。优选的，步骤2)中所述重叠延伸PCR的体系，以50μL计，包括以下组分：2×TaqPCR预混试剂Ⅱ25μL，170ng/μL的带有粘性末端的BZLF1基因2μL，175ng/μL的带有粘性末端的EBNA12μL、引物F11μL、引物F41μL和ddH2O19μL。本专利技术提供了一种重组腺病毒，包括初始腺病毒载体和所述的融合基因。优选的，所述初始腺病毒载体包括pDC316-mCMV-EGFP载体。优选的，所述融合基因位于所述pDC316-mCMV-EGFP载体的HindⅢ和EcoRV酶切位点之间。本专利技术提供了所述的重组腺病毒的制备方法，包括以下步骤：将初始腺病毒载体和所述的融合基因分别双酶切后、连接获得重组载体pDC316-BFNA-EGFP；将所述重组载体pDC316-BFNA-EGFP与腺病毒大骨架载体pBHGIOXE1,3Cre共转染HEK293细胞获得重组腺病毒。本专利技术提供了所述的融合基因、所述的重组腺病毒在制备治疗肿瘤的药物中的应用。本专利技术的有益效果：本专利技术提供的所述融合基因BFNA是将去除重复结构域EBNA1基因与BZLF1基因(去除庸余序列)进行融合获得，所述融合基因的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。本专利技术中包括所述融合基因的重组腺病毒对于肿瘤具有显著的抑制作用，能够延长成瘤时间，抑瘤率达到82％以上；所述重组腺病毒还能够促进机体中CD4+T细胞和CD8+T细胞等免疫细胞的增殖，提高CD4+T细胞和CD8+T细胞等免疫细胞的含量。附图说明图1为EB病毒基因序列示意图；图2为Westernblot检测融合基因编码蛋白的表达情况，其中A1为重组腺病毒(BZLF1蛋白)B1为腺病毒；A2腺病毒；B2为重组腺病毒(LMP2蛋白)；图3为实施例1中流式细胞术分析不同处理组中CD4+T细胞、CD8+T细胞增殖情况；图4为实施例1中不同处理组淋巴细胞浸润情况，其中A为PBS组；B为腺病毒组；C为重组腺病毒组。具体实施方式本专利技术提供了一种融合基因BFNA，所述融合基因BFNA的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。在本专利技术中，所述融合基因的核苷酸序列具体如下：atgatctaatggactgacctaaggcctcggctaatggacccaaactcgacttctgaagatgtaaaatttacacctgacccataccaggtgccttttgtacaagcttttgaccaagctaccagagtctatcaggacctgggagggccatcgcaagctcctttgccttgtgtgctgtggccggtgctgccagagcctctgccacaaggccagctaactgcctatcatgtttcaaccgctccgactgggtcgtggttttctgcccctcagcctgctcctgagaatgcttatcaagcttatgcagcacctcagctgttcccagtctccgacataacccagaatcaacagactaaccaagccgggggagaagcacctcaacctggagacaattctactgttcaaacagcagcagcagtggtgtttgcttgccccggggctaaccaaggacaacagctagcagacattggtgttccacagcctgcaccagtggctgccccggcacgacgcacacggaaaccacaacagc本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种融合基因BFNA，其特征在于，所述融合基因BFNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种融合基因BFNA，其特征在于，所述融合基因BFNA的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。


2.权利要求1所述的融合基因BFNA的制备方法，包括以下步骤：
1)分别以包括BZLF1基因和包括EBNA1基因的cDNA为模板进行PCR扩增，获得带有粘性末端的BZLF1基因片段和带有粘性末端的EBNA1基因片段；
2)以所述带有粘性末端的BZLF1基因片段和带有粘性末端的EBNA1基因片段为模板进行重叠延伸PCR扩增获得融合基因；
步骤1)中扩增BZLF1基因的引物包括F1和F2，所述F1的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示；所述F2的核苷酸序列如SEQIDNo.3所示；
步骤1)中扩增EBNA1基因的引物包括F3和F4，所述F3的核苷酸序列如SEQIDNo.4所示；所述F4的核苷酸序列如SEQIDNo.5所示；
步骤2)中扩增获得融合基因的引物包括F1和F4。


3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述包括BZLF1基因和包括EBNA1基因的cDNA来源于B95-8EB病毒阳性细胞。


4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤2)中所述重叠延伸PCR的程序包括以下步骤：95℃预变性3min；95℃变性40s，55℃退火40s，72℃延伸1min，共40个循...

【专利技术属性】
技术研发人员：薛庆节，黄烁，王子豪，闫迎春，陈廷，
申请(专利权)人：济宁医学院，
类型：发明
国别省市：山东;37