一种抗HPV6卵黄抗体及其制备方法和用途技术

本发明专利技术提供了一种抗HPV6卵黄抗体及其制备方法和用途，本发明专利技术提供了HPV6型抗原的序列，利用该抗原制备卵黄抗体的方法和将其用于预防及治疗HPV6感染的医学用途。应用本发明专利技术技术方案制备卵黄抗体无需大规模体外培养及收集病毒，且制得的抗体与全病毒制备的抗体比较，无效及作用较弱的抗体含量低，具有纯度高、特异性强、无毒副作用、成本低廉、利于大规模生产等优点。

【技术实现步骤摘要】
一种抗HPV6卵黄抗体及其制备方法和用途
本专利技术属于生物医药及医疗器械领域，特别涉及一种抗HPV6卵黄抗体及其制备方法和用途。
技术介绍
人类乳头瘤病毒(HumanPapillomaVirus)属于乳多空病毒科的乳头瘤空泡病毒A属，是一种球形双链DNA病毒，主要传播方式为性传播，简称HPV。其临床主要类型有HPV1、2、6、11、16、18、31、33及35型等，其又可分为高危型及低危型，其中HPV16和HPV18型长期感染可能引起宫颈癌，被称为高危型，其余类型多引起生殖器疱疹及皮肤疱疹，国内临床感染以低危型HPV6/11和高危型HPV16/18最为常见。目前临床治疗HPV感染，主要以抗病毒为主，常用干扰素、卡拉胶等辅助治疗，直接抗病毒类药物作用有限，且治疗周期较长，长期给药也对机体造成一定的影响。市面上流行的栓剂、凝胶制剂其有效成分多为抗生素、中药组方或提取物，较为新颖的为多肽制剂，经过模型实验均有一定效果，但其给药周期也较长多为1月到3月不等，且基本为发病后给药，本专利技术立足于预防为主，兼具有一定治疗效果，提供卵黄抗体制备的洗剂可日常清洁消毒使用，利于早期预防治疗HPV感染。HPV疫苗在国内也已上市，有四价及九价等不同规格，但其适宜年龄基本为14-25岁之间接种，而HPV的发病周期基本可扩展至女性绝经前。这使得这一制剂有广泛的市场，目前经报道的HPV卵黄抗体制品是应用全病毒免疫，其产生的抗体多为无效抗体，只有少部分为中和抗原产生的抗体，应用效果有待提高，且全病毒体外培养及收集需细胞培养扩增，产率极低，成本极高不利于大规模生产。针对HPVL1、L2抗原制备的抗体为预防及中和抗体，而针对E6、E7衣壳蛋白制备的抗体属于治疗性抗体。本专利技术针对L1、L2蛋白进行优化，去除了不易暴露的抗原氨基酸序列，保留主要抗原决定簇并把两个抗原蛋白串联，提高了表达效率，所得的卵黄抗体对HPV的特异性及针对性更强。制备的卵黄抗体所含有效抗体的数量更高，效价也更高。
技术实现思路
基于当前临床应用需求，本专利技术提供了一种抗HPV6卵黄抗体及其制备方法和用途，本专利技术将优化后串联的L1、L2重组抗原用于制备卵黄抗体，本专利技术同时也公开了将其用于预防及治疗HPV6感染的医学用途。为实现上述目的，本专利技术的技术方案为：本专利技术提供了一组重组DNA，所述重组DNA包括HPV6L1、L2氨基酸序列及lingker序列，所述重组DNA的氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。本专利技术提供了一种重组DNA制备的HPV6型抗原。进一步的，所述HPV6型抗原包含HPV6型L1、L2的特异性抗原序列片段、lingker序列，氨基酸序列如SEQIDNO：1所示。本专利技术提供了一种由上述重组DNA或上述重组抗原制备的卵黄抗体。进一步的，所述卵黄抗体的制备方法如下：(1)抗原制备：选取重组DNA，表达，转化获得重组蛋白，作为免疫用抗原；(2)免疫蛋黄的获取：用(1)中所述免疫抗原注射产蛋鸡，收集鸡胚，提取卵黄；(3)卵黄抗体的提取纯化：收集(2)所述的卵黄，离心、透析、并进行溶液处理、最终得到卵黄抗体纯品。进一步的，制备过程中的免疫用抗原通过将序列定点亚克隆至pET-28a(+)载体中，制备重组表达质粒；再将其转化至E.coliBL21(DE3)中，IPTG诱导表达，获得重组蛋白。本专利技术提供了卵黄抗体在预防和治疗HPV6型病毒感染制剂中的应用。进一步的，所述的卵黄抗体在预防和治疗HPV6型病毒感染的制剂为软膏剂、乳膏剂、混悬剂、洗剂、散剂、溶液剂、糊剂、凝胶剂、喷雾剂、气雾剂、油制剂或透皮贴剂。本专利技术具有以下优点及有益效果：本专利技术利用L1及L2部分片段串联的重组蛋白做为抗原，其特异性高，针对性优于全病毒作为抗原制备的卵黄抗体。该方法避免了费时、费力、成本较高的活体病毒大规模体外培养过程，产生的抗体只针对衣壳蛋白，避免了不产生中和作用的其余抗原抗体的产生，效率更高。本专利技术在用于预防及治疗HPV6轻度感染时具有成分安全，不产生耐药性的优点。本方法制备的卵黄抗体成本低廉，工艺简单，易于大规模生产的优点。具体实施方式实施例1：重组抗原制备通过选取HPV6型L1、L2氨基酸序列作为模板，保留主要抗原决定簇，每个抗原决定簇之间选用lingker链接，并串联了L1、L2序列，优化后的抗原的氨基酸序列为SEQIDNO：1，共695个氨基酸；选取原核表达系统复性纯化后的重组蛋白作为免疫抗原，针对选取的抗原决定簇序列，合并设计了其表达所需要的核苷酸序列如SEQIDNO：2，共2085bp。利用含特定酶切位点亚克隆至pET-28a(+)载体中，制备重组表达质粒。并将其转化至E.coliBL21(DE3)中，利用终浓度为1mM的IPTG进行诱导表达。纯化重组蛋白并利用尿素梯度复性，恢复原有的免疫原性，免疫产蛋鸡，每次每只2mg，免疫三次后再加强免疫一次。加强免疫后10d开始收集鸡胚，常规方法纯化获取卵黄抗体。以上序列委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成并测序。设计引物并合成引物，序列如下：合成SEQIDNO：2序列的引物：HPV6上游：5’-TCAGAGCTCATGTGGCGGCCTAGCG-3’(SEQIDNO：3)；HPV6下游：5’-GACCTCGAGTTACACAAGAGGGTG-3’(SEQIDNO：4)。引物交由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。引物合成后超纯水稀释(按照引物合成管上的标注体积稀释)。保存在-20℃备用。按照以下反应体系PCR扩增基因片段，并凝胶回收(按照天根生化科技(北京)有限公司试剂盒操作说明书操作)。PCR反应体系为：模板(合成产物)1μL；上游引物1μL；下游引物1μL；2×MasterMix10μL；水8μL。PCR反应条件为：95℃10min；94℃90s，53℃90s，72℃90s，共30个循环；72℃10min。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定。将PCR产物和pMD-18T连接8h，连接产物加入感受态E.coliTop10中冰浴30min，42℃热休克90s，随后立即冰浴2-3min。涂板(含氨苄西林100μg/ml的LB平板)37℃培养过夜。挑取阳性菌落并接入LB培养基摇菌，提取质粒，经PCR及双酶切鉴定，重组质粒送生北京工生物工程有限公司测序。双酶切重组克隆质粒阳性质粒和表达载体pET-28a(+)，回收目的基因片段，用T4DNA连接酶16℃连接过夜，将连接产物转化到大肠杆菌BL21中。挑取含有阳性质粒的单菌落，加入含50μg/ml卡那霉素LB液体培养基中,37℃振荡培养至菌液A600达0.5时，加入终浓度为1mmol/LIPTG诱导表达，37℃振荡诱导培养4h后离心，收集菌体。取5ml菌液，4℃，5000g/min离心3min，超声破碎后，加入SDS上样Buffer，煮沸10min，进行SDS-PAGE鉴定。超声产物，1200本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一组重组DNA，其特征在于，所述重组DNA包括HPV6 L1、L2氨基酸序列及lingker序列，所述重组DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。/n

【技术特征摘要】
1.一组重组DNA，其特征在于，所述重组DNA包括HPV6L1、L2氨基酸序列及lingker序列，所述重组DNA的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。


2.权利要求1所述的重组DNA制备的HPV6型抗原。


3.根据权利要求2所述的重组DNA制备的HPV6型抗原，其特征在于，所述HPV6型抗原包含HPV6型L1、L2的特异性抗原序列片段、lingker序列，氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。


4.权利要求1所述的重组DNA或权利要求2所述的重组抗原制备的抗HPV6卵黄抗体。


5.根据权利要求4所述的抗HPV6卵黄抗体的制备方法，其特征在于，
（1）抗原制备：选取重组DNA，表达，转化获得重组蛋白，作为免疫用抗原；
（2）免疫蛋黄的获取：用（1）...

【专利技术属性】
技术研发人员：高江明，徐晓芳，杨萌琳，
申请(专利权)人：徐晓芳，
类型：发明
国别省市：山东;37