一种腺病毒四价疫苗制造技术

本发明专利技术公开了一种腺病毒四价疫苗，其包括复制缺陷型人3型腺病毒、4型腺病毒、7型腺病毒和55型腺病毒，所述复制缺陷型人3型腺病毒、4型腺病毒、7型腺病毒和55型腺病毒的E1、E3基因缺失，E4基因的部分编码框置换为人5型腺病毒E4基因的相应编码框。本发明专利技术的腺病毒四价疫苗能够有效刺激机体产生体液免疫应答和细胞免疫应答，产生高效价的特异性中和抗体，用于预防病原体的感染。

【技术实现步骤摘要】
一种腺病毒四价疫苗
本专利技术属于病毒免疫学
，具体涉及一种腺病毒四价疫苗。
技术介绍
腺病毒(Adenovirus，Ad)是双链DNA病毒，其基因组长度约35-40kb。已知人腺病毒分为7个亚群(A～G)，包括50多个血清型及90多个基因型，感染患者后主要引起急性呼吸道疾病(腺病毒B和C亚群)、结膜炎(腺病毒B和D亚群)和胃肠炎(腺病毒F亚群41型和42型，G亚群52型)。腺病毒导致的呼吸道感染多由腺病毒3型、4型和7型引起，近年来腺病毒11型和14型导致的上呼吸道感染和肺炎逐渐增多，而且病毒常常发生变异，导致呼吸道疾病暴发流行。2006年保定市解放军252医院收治了一些呼吸道感染发热病人，确诊为腺病毒55型引起的呼吸道感染。腺病毒55型也是由腺病毒11型和14型基因重组而来的变异病毒。Ad4和Ad7主要集中在部队、学校等青年和青少年聚集的地方爆发，甚至导致病人的死亡。但是，尚无治疗腺病毒感染的特效药物，临床上只能采取支持性治疗。目前，抗腺病毒感染的疫苗仅在美国军队获得使用。该疫苗为野生型Ad4、Ad7在人胚肾二倍体成纤维细胞上传代，经冷冻脱水、混和纤维素乳糖等制成的肠溶型胶囊形式的口服活病毒疫苗。该疫苗的使用有效控制了美军腺病毒感染疫情的爆发。但是，美军使用的Ad4和Ad7苗存在极大的风险，该疫苗主要是低剂量野生型腺病毒，安全性较差，存在残余活病毒从肠道排出后污染生活环境的风险，极易造成病毒的二次污染，因而不能广泛应用于普通人群。所以，研制安全性高并能预防强病毒株的复制缺陷型腺病毒疫苗是十分必要的。复制缺陷型腺病毒载体已经被广泛的应用于疫苗研发、基因治疗等领域，其不仅安全性好，并且在生物体内又发生较强的免疫反应。已有研究显示，腺病毒E1基因是其复制增殖的必需基因，E3基因在抵抗宿主的免疫系统中起关键性作用。敲除E1、E3基因后，腺病毒在正常人体内丧失复制能力，在此方面具有减毒表型。同时，Ad3、Ad4、Ad7和Ad55主要的表面抗原Hexon、Fiber等则不受影响，不会影响疫苗的免疫原性。因此，采用复制缺陷的腺病毒作为疫苗可有效增加疫苗的全性和使用范围。但是，研究发现很多腺病毒，尤其是非C亚群腺病毒，敲除E1、E3基因后在生产细胞株中产量较低，其主要原因是Ad5E1B55K不能与B亚型腺病毒E4Orf6蛋白产生相互作用，不能有效抑制宿主细胞mRNA的出核，不能提高病毒晚期蛋白的表达。这些腺病毒需要表达相应E1基因的293细胞株或其他细胞株才能生产。因此，仅敲除E1、E3基因的复制缺陷型Ad3、Ad4和Ad7在疫苗生产细胞株293或PerC6种难以生产。因此，提升复制缺陷型腺病毒在这些细胞株中的生产能力是当前需要解决的瓶颈技术问题。
技术实现思路
本专利技术的目的在于为了克服现有技术缺陷，提供一种可在疫苗生产细胞株中大规模扩增的复制缺陷型重组Ad3、Ad4、Ad7和Ad55的备方法和应用，及复制缺陷型重组Ad3、Ad4、Ad7和Ad55以一定的比例混合制备四价疫苗，该疫苗免疫机体可以有效刺激机体产生特异性体液免疫和细胞免疫反应，产生特异性Ad3、Ad4、Ad7和Ad55中和抗体，用于预防Ad3、Ad4、Ad7和Ad55的病原体的感染。本专利技术所采取的技术方案是：一种组合物，其包括复制缺陷型人3型腺病毒、4型腺病毒、7型腺病毒和55型腺病毒。所述复制缺陷型人3型腺病毒、4型腺病毒、7型腺病毒和55型腺病毒的E1、E3基因缺失，E4基因的部分编码框置换为人5型腺病毒E4基因的相应编码框。所述E4基因的编码框包括Orf2、Orf3、Orf4Orf6编码框。作为优选地，所述复制缺陷型人3型腺病毒、4型腺病毒、7型腺病毒、55型腺病毒中至少有一种的E1基因区域整合外源基因表达框。进一步优选地，所述复制缺陷型人3型腺病毒、4型腺病毒、7型腺病毒和55型腺病毒颗粒数按比1：1：1：1的比例混合。以上所述的组合物在制备疫苗或药物中的应用。一种腺病毒四价疫苗制剂，其包括以上所述的组合物。作为优选地，所述制剂还包括药学上可接受的佐剂、载体、稀释剂或赋形剂。本专利技术的有益效果是：(1)本专利技术在敲除E1和E3基因的基础上，将Ad3、Ad4、Ad7和Ad55的E4基因部分编码框置换为Ad5E4基因的相应编码框，大大提升复制缺陷型Ad3、Ad4、Ad7和Ad55的安全性及其在生产细胞株中的复制能力。(2)本专利技术制备得到的Ad3、Ad4、Ad7和Ad55四价疫苗经初免和加强免后，能够有效在实验动物体内诱导产生Ad3、Ad4、Ad7和Ad55特异性体液免疫和细胞免疫，产生特异性Ad3、Ad4、Ad7和Ad55中和抗体，用于预防Ad3、Ad4、Ad7和Ad55的病原体的感染。与市面上Ad4和Ad7二价活疫苗(美国)相比较，本专利技术的四价疫苗在保留了Ad3、Ad4、Ad7和Ad55的免疫原性的条件下大大提高了疫苗的安全性、保护范围和使用范围。附图说明图1为pAd3ΔE1ΔE3质粒构建流程图。图2为pAd3ΔE1ΔE3(Orf2-6)质粒构建流程图。图3为pAd3ΔE1ΔE3(Orf2-6)-EGFP质粒构建流程图。图4为pAd3ΔE1ΔE3质粒、pAd3ΔE1ΔE3(Orf2-6)质粒、pAd3ΔE1ΔE3(Orf2-6)-EGFP的酶切鉴定结果图。图5为复制缺陷型Ad3载体的生产及纯化结果图。图6为复制缺陷型Ad3载体在HEK293及A549细胞中的噬斑形成实验结果。图7为pAd4质粒构建流程图。图8为pAd4ΔE3质粒的构建流程图。图9为pAd4ΔE1ΔE3质粒的构建流程图。图10为pAd4ΔE1ΔE3(Orf2-6)质粒的构建流程图。图11为pAd4ΔE1ΔE3(Orf2-6)-EGFP质粒的构建流程图。图12为pAd4质粒、pAd4ΔE3质粒、pAd4ΔE1ΔE3质粒、pAd4ΔE1ΔE3(Orf2-6)质粒、pAd4ΔE1ΔE3(Orf2-6)-EGFP的酶切鉴定结果图。图13复制缺陷型Ad4载体的生产及纯化结果图。图14为复制缺陷型Ad4载体在HEK293及A549细胞中的噬斑形成实验结果。图15为pAd7质粒的构建流程图(A)和酶切鉴定结果图(B)。图16为pAd7ΔE3质粒的构建流程图(A)和酶切鉴定结果图(B)。图17为pAd7ΔE1ΔE3质粒的构建流程图(A)和酶切鉴定结果图(B)。图18为pAd7ΔE1ΔE3(Orf2-6)质粒的构建流程图(A)和酶切鉴定结果图(B)。图19为pAd7ΔE1ΔE3(Orf2-6)-EGFP质粒的构建流程图(A)和酶切鉴定结果图(B)。图20为复制缺陷型Ad7载体的生产及纯化结果图。图21为复制缺陷型Ad7载体在HEK293及A549细胞中的噬斑形成实验结果。图22为pAd55ΔE1ΔE3-Kana质粒的构建流程及酶切鉴定结本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种组合物，其包括复制缺陷型人3型腺病毒、4型腺病毒、7型腺病毒和55型腺病毒。/n

【技术特征摘要】
1.一种组合物，其包括复制缺陷型人3型腺病毒、4型腺病毒、7型腺病毒和55型腺病毒。


2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述复制缺陷型人3型腺病毒的E1、E3基因缺失，E4基因的部分编码框置换为人5型腺病毒E4基因的相应编码框。


3.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述复制缺陷型人4型腺病毒的E1、E3基因缺失，E4基因的部分编码框置换为人5型腺病毒E4基因的相应编码框。


4.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述复制缺陷型人7型腺病毒的E1、E3基因缺失，E4基因的部分编码框置换为人5型腺病毒E4基因的相应编码框。


5.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述复制缺陷型人55型腺病毒的E1、E3基因缺失，E4基因的部分编码框置换为人5型腺病毒E4基因的相应编码框。


6.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述E4基因的部分编码框包括Orf2、Orf3、Orf4和Orf6编码框。


7.根据权利要求3所述的组合物，其特征在于，所述E4基因的部...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈凌，杨臣臣，冯立强，
申请(专利权)人：广州恩宝生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44