一种复制型人腺病毒及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种复制型人腺病毒及其应用。载体全序列如SEQ ID NO.：21所示。本发明专利技术一些实例所述的复制型人腺病毒，在负载相关核酸序列后，可以直接注射于实体肿瘤，包括但不限于H1299，还包括Skov

【技术实现步骤摘要】
一种复制型人腺病毒及其应用


[0001]本专利技术涉及基因治疗领域，特别涉及重组溶瘤腺病毒、用于制备重组溶瘤腺病毒的重组溶瘤腺病毒载体及其应用。

技术介绍

[0002]癌症由自身因素(遗传基因突变，自然衰老等)或环境因素(如吸烟，紫外辐射，化学物质，病毒感染等)引起。根据WHO报道，肿瘤目前已经是继心血管疾病的世界第二大死因，全球有近1/6的死亡是由癌症造成的。2018年全球癌症死亡人数达960万。预计到2025年，全球每年新增癌症病例数将高达2449万例。其中，肺癌的死亡人数最多，随后是结直肠癌，胃癌，肝癌和乳腺癌。
[0003]治疗癌症的经典方法主要是手术，化学疗法，和放射性疗法。手术切除效果有限，对转移癌细胞没有作用；放疗和化疗副作用大，尽管靶点药物在很大程度上改善了患者生活质量，但耐受性是化疗一直面临的一个难题。近年来，免疫疗法已成为癌症治疗领域的热点。免疫疗法的原理是通过激活机体自身的免疫系统来消灭肿瘤细胞，具有疗效好，副作用小和防止复发等优点。
[0004]近几年溶瘤病毒在癌症治疗领域又重新兴起。溶瘤病毒(oncolytic virus)，是一类具有复制能力，能够直接裂解肿瘤细胞的病毒。早在1912年，意大利医生就发现一名子宫颈癌患者在感染狂犬病病毒后肿瘤随之消退。2005年中国批准了世界上第一个溶瘤腺病毒(H101)上市，但临床疗效目前还未得到国际认可。该病毒敲除了E1B-55K和E3区大部分基因。E1B-55K蛋白能够抑制抗癌基因p53的表达，阻止P53介导的感染细胞的凋亡。由于正常的细胞中的P53蛋白功能完好，而大部分肿瘤丧失P53功能，因此，E1B-55K基因的删除使病毒能特异性在缺乏有功能的p53的肿瘤细胞内复制。然而，E1B-55K蛋白是病毒mRNA从细胞核输出必需的蛋白，因此，H101复制能力和溶瘤能力比野生毒株明显减弱。2015年，FDA批准了第一个溶瘤病毒疗法T-vec(单纯疱疹病毒-1)用于治疗手术切除后复发的黑色素瘤。作为第三代溶瘤病毒，T-vec删除了γ34.5基因，使其具有肿瘤细胞靶向性，同时它还携带了GM-CSF(粒细胞-巨噬细胞集落因子)增强抗肿瘤免疫能力。
[0005]溶瘤病毒是免疫疗法的一个重要分支，其可以通过多种不同的作用途径杀伤肿瘤细胞，并破坏肿瘤免疫抑制的微环境诱导长期的肿瘤特异性免疫反应，同时还可以通过携带治疗基因使其在肿瘤细胞中特异地，长时间地表达，从而增强抗肿瘤疗效。另外，溶瘤病毒与其他抗癌药物的联合用药的实验结果如联合免疫检查点抑制剂等方面都显现出良好的抗肿瘤效果。近年来，许多病毒包括痘苗病毒、呼肠孤病毒、麻疹病毒、单纯疱疹病毒、新城疫病毒以及柯萨奇病毒已经作为溶瘤剂进行了临床试验。
[0006]腺病毒(adenovirus)是一种没有包膜的直径为70～90nm的颗粒，由252个壳粒呈廿面体排列构成。每个壳粒的直径为7～9nm。衣壳里是线状双链DNA分子，约含4.7kb，两端各有长约100～600bp的反向末端重复序列。人腺病毒(Human adenoviruses，HAdV)属于腺病毒科(Adenoviridae)，根据免疫学、生物学、生物化学特性不同，将其分为A～G7个亚种，
共有52个血清型，不同的血清型有不同的器官亲和性并引起相应的临床表现。腺病毒侵入宿主细胞后至少能引起3种感染：慢性、潜伏性感染：常在淋巴细胞内发生，潜伏感染时外放的病毒量极少，细胞坏死也不明显，故临床上感染不明显，潜伏感染的机制尚不清楚。溶解性感染：病毒在细胞内如人类上皮细胞中经历复制过程，通过溶解细胞作用使细胞死亡。肿瘤样变异：此时病毒繁殖只进行最初几步，然后腺病毒DNA与细胞DNA整合并复制，但不产生感染性病毒，腺病毒抗原性较稳定。
[0007]周立,何婉婉,朱桢楠,et al.溶瘤腺病毒靶向癌症治疗的临床研究进展[J].中国生物工程杂志,2013,33(12):105-113.指出，溶瘤腺病毒能够特异性地感染肿瘤细胞并在肿瘤细胞中完成感染-复制周期，从而特异性地杀伤和裂解肿瘤细胞但不损伤其他正常细胞和组织，因此成为目前最具研究前景的抗肿瘤药物之一。不同的病毒有着复杂的生物学特性，而目前人类完全熟悉的病毒资源仍旧比较匮乏。尤其大多临床前实验资料均是来自免疫缺陷动物体内人肿瘤移植模型，与人在体内环境、组织细胞的生物学特性等方面都存在很大差异。已有的溶瘤腺病毒之间并无明显的共性，难以基于腺病毒的序列确定其是否具有溶瘤效果，但大多数腺病毒对肿瘤细胞不敏感，不具有溶瘤的特性。

技术实现思路

[0008]本专利技术的目的在于克服现有技术中的至少一种不足，提供一种溶瘤腺病毒载体及其应用。
[0009]本专利技术所采取的技术方案是：
[0010]本专利技术的第一个方面，提供：
[0011]一种复制型人腺病毒，其全序列如SEQ ID NO.：21所示，其中的抗性筛选基因可使用公知的筛选基因替换。
[0012]在一些实例中，所述复制型人腺病毒的全序列如SEQ ID NO.：21所示。
[0013]在一些实例中，所述病毒的E1区和E3区被删除。
[0014]在一些实例中，所述病毒可在动物细胞、人源细胞或人体内复制。
[0015]在一些实例中，所述复制型人腺病毒的构建方法包括：
[0016]S1)PCR扩增获得NBOV1901基因组的左右两端，连接在抗性载体质粒A得到pT-NBOV1901(L+R)，线性化后与NBOV1901基因组重组得到基因组质粒pNBOV1901；
[0017]S2)PCR扩增获得从SrfI至整个E3区左右臂连接至抗性载体质粒B上，线性化后与PacI酶切的NBOV1901进行重组，得到去除SrfI至整个E3区的基因组质粒pNBOV1901
△
E3-SrfI；
[0018]S3)以NBOV1901基因组为模板，PCR扩增获得E3gp19K上游片段：SrfI至E3gp19K，和E3gp19K下游片段：E3gp19K至E3区包含E3-14.7K基因片段，将E3gp19K上游片段、E3gp19K下游片段和酶切后的构建载体三个片段重组连接至pNBOV1901
△
E3-SrfI左右臂之间，线性化后与pNBOV1901
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E3-SrfI进行重组，得到修改了SrfI酶切位点的基因组质粒pNBOV1901
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E3gp19K；
[0019]S4)PCR扩增获得E1区左右臂连接至抗性载体质粒B上，线性化后与SrfI酶切的pNBOV1901
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E3gp19K重组，得到去除E1区的基因组质粒pNBOV1901
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E3gp19K
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E1；
[0020]S5)PCR扩增获得去除E1b19K、pRB基因的E1区基因组，连接至含有E1区左右臂的抗
性载体质粒B上，线性化后与酶切后的pNBOV1901
△
E3gp19K
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E1进行重组，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种复制型人腺病毒，其核苷酸序列如SEQ ID NO.：21所示。2.如权利要求1所述复制型人腺病毒，其特征在于：所述病毒的E1区和E3区被删除。3.如权利要求1所述复制型人腺病毒，其特征在于：所述病毒可在动物细胞、人源细胞或人体内复制。4.一种组合物，其特征在于：其含有权利要求1所述的复制型人腺病毒。5.根据权利要求4所述的组合物，其特征在于，所述组合物中包括：a)免疫调控剂；b)免疫调控细胞；c)放射性治疗物；d)光疗法化合物；或e)化学治疗化合物中的至少一...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈凌，关素华，刘波，
申请(专利权)人：广州恩宝生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：