靶向超敏广谱溶瘤病毒制备及应用制造技术

本发明专利技术公开了靶向超敏广谱溶瘤病毒制备及应用，所述靶向超敏广谱溶瘤病毒为一种包含重组新城疫病毒、超敏基因α

【技术实现步骤摘要】
靶向超敏广谱溶瘤病毒制备及应用


[0001]本专利技术属于基因工程
，涉及一种熔化肿瘤物理屏障的靶向超敏广谱溶瘤病毒及其制备和应用。

技术介绍

[0002]乙酰肝素酶（heparanase，HPSE）是哺乳动物细胞中唯一能切割细胞外基质中硫酸肝素蛋白多糖侧链（heparan sulfate chains，HS）的内源性糖苷酶（即在特定部位裂解硫酸乙酰肝素蛋白聚糖）。近年来研究发现，乙酰肝素酶在肿瘤免疫监视中起重要作用，一方面，激活自然杀伤细胞（natural killer，NKC）；另一方面，通过切割HS链和随后的细胞外基质（extracellular matrix，ECM）降解而破坏肿瘤组织中的物理屏障，趋化因子得以进入肿瘤间质，吸引NK细胞、T细胞、树突状细胞（dendritic cells，DC）向肿瘤部位聚集，增强抗肿瘤免疫反应。
[0003]成纤维细胞活化蛋白(fibroblast activation protein FAP)是基质中的一种表面抗原，多种恶性肿瘤都有表达。肿瘤组织需要通过新生血管与活化的成纤维细胞等基质形成来获取肿瘤细胞存活和生长所必需的营养物质。肿瘤相关成纤维细胞中FAP含量丰富，可以激活基质中的生长因子等，以利于血管生成，从而促进肿瘤生长、转移。在以肿瘤基质为靶点的抗肿瘤免疫治疗中发挥作用，显著诱导肿瘤相关成纤维细胞的凋亡。FAP在肿瘤的发生、发展及转移中发挥着重要作用，同时作为一种理想的抗肿瘤靶分子。将FAPscFv重组入NDV，溶解肿瘤细胞的同时，破坏了肿瘤生长的外基质，破坏了种子成长所需要的土壤，干扰肿瘤细胞的生长和侵袭。
[0004]溶瘤病毒（oncolytic virus）是能特异性感染癌细胞并大量复制，最终裂解癌细胞后释放出来，再感染更多癌细胞的一类病毒。新城疫病毒是一种天然的单股负链RNA非致病性溶瘤病毒，在癌细胞内具有很高的复制效率（是正常细胞中的10000倍）和一定的溶瘤能力。NDV 通过与癌细胞表面所分布丰富的NDV 受体
‑‑‑
唾液酸残基结合而进入细胞内。由于癌细胞缺乏抗病毒、凋亡途径和Ⅰ型INF信号传导通路，NDV选择性地只能在癌细胞内复制而不感染正常细胞，因而能广泛杀伤癌细胞，而不会伤及人类正常组织。此外，新城疫病毒使肿瘤细胞裂解后释放肿瘤特异性抗原，一定程度上能刺激免疫细胞活化而诱导肿瘤免疫反应。
[0005]既往专利报道新城疫病毒NDV杀伤力不强，抗癌作用尚不甚理想，靶向性差和基因药物组织特异性表达不理想。目前实体肿瘤治疗疗效差的原因之一就是药物无法进入肿瘤内部。

技术实现思路

[0006]为了解决现有技术存在的不足，本专利技术的目的是提供一种熔化肿瘤物理屏障病毒及其应用（一种熔化肿瘤物理屏障的靶向超敏广谱溶瘤病毒及其制备和应用）。
[0007]本专利技术提供了一种包含重组新城疫病毒NDV
‑
GHF质粒的重组病毒，所述重组病毒
由重组新城疫病毒NDV
‑
GHF质粒与辅助质粒共转染BSR细胞拯救获得。
[0008]本专利技术中所述包含重组新城疫病毒NDV
‑
GHF质粒的重组病毒是指包含重组新城疫病毒NDV、超敏基因α
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1,3 GT、溶解细胞外基质的乙酰肝素酶基因HPSE和靶向肿瘤相关成纤维细胞的FAP scFv基因（NDV
‑ꢀ
GT
‑
HPSE
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FAP scFv，简称NDV
‑
GHF）质粒的重组病毒。
[0009]所述辅助质粒包括N、P、L等。
[0010]所述N具体指表达NDV的NP蛋白的质粒。
[0011]所述P具体指表达NDV的P蛋白的质粒。
[0012]所述L具体指表达NDV的L蛋白的质粒。
[0013]所述重组新城疫病毒NDV
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GHF质粒是将NDV与α
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1,3 GT、HPSE和FAP scFv基因进行重组后的重组新城疫病毒NDV
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GHF质粒；所述HPSE基因的序列如SEQ ID NO:1所示；所述FAP scFv基因的序列如SEQ ID NO:2所示；所述α
‑
1,3 GT基因的序列如SEQ ID NO:3所示。
[0014]所述新城疫病毒（野生型新城疫病毒）NDV的序列如GenBank FJ766530.1公布。
[0015]所述包含重组新城疫病毒NDV
‑
GHF质粒的重组病毒的序列是在野生型新城疫病毒NDV的序列（GenBank FJ766530.1）中插入α1,3 GT、HPSE和FAP scFv基因的序列。
[0016]本专利技术还提供了上述重组病毒在融化肿瘤物理屏障中的应用。
[0017]本专利技术还提供了上述重组病毒制备预防和/或治疗新城疫病毒疫苗中的应用。
[0018]其中，所述重组病毒用于抑制肿瘤的生长、增殖、迁徙、转移，或促进肿瘤的凋亡。
[0019]本专利技术所述的包含重组新城疫病毒NDV
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GHF质粒的重组病毒能直接攻击物理屏障、肿瘤相关成纤维细胞和癌细胞，破坏细胞外基质，抑制新的胶原蛋白形成，又能产生HPSE清除已有的物理屏障，释放趋化因子吸引免疫细胞到肿瘤部位，增强抗肿瘤效果。
[0020]本专利技术还提供了一种重组新城疫病毒NDV
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GHF质粒，其为将新城疫病毒NDV与α
‑
1,3 GT、HPSE和FAP scFv基因进行重组后的重组新城疫病毒NDV
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GHF质粒。
[0021]所述重组新城疫病毒NDV
‑
GHF质粒的载体是JS/0704/Pi，所述α
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1,3 GT、HPSE和FAP scFv基因插入的位点为Age I、SanD I。
[0022]所述HPSE基因的序列如SEQ ID NO:1所示；所述FAP scFv基因的序列如SEQ ID NO:2所示；所述α
‑
1,3 GT基因的序列如SEQ ID NO:3所示。
[0023]所述野生型新城疫病毒NDV的序列如GenBank FJ766530.1公布。
[0024]本专利技术还提供了所述的重组新城疫病毒NDV
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GHF质粒在构建包含重组新城疫病毒NDV
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GHF质粒的重组病毒中的应用。
[0025]本专利技术还提供了一种制备上述重组病毒的制备方法，所述方法包括如下步骤：步骤一、构建所述重组新城疫病毒NDV
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GHF质粒；步骤二、提取包含测序正确的重组新城疫病毒NDV
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GHF质粒；步骤三、BSR细胞复苏、换液、传代和铺板；步骤四、利用痘苗病毒感染BSR细胞，然后用步骤二中提取的重组NDV
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GHF质粒对BSR细胞进行转染；步骤五、取转染后的细胞上清接种到鸡胚中，拯本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种包含重组新城疫病毒NDV
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GHF质粒的重组病毒，其特征在于，所述重组病毒由重组新城疫病毒NDV
‑
GHF质粒与辅助质粒共转染BSR细胞拯救获得；所述重组新城疫病毒NDV
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GHF质粒是将新城疫病毒NDV与α
‑
1,3 GT、HPSE和FAP scFv基因进行重组后的重组新城疫病毒NDV
‑
GHF质粒。2.如权利要求1所述的重组病毒，其特征在于，所述辅助质粒包括N、P、L。3.如权利要求1所述的重组病毒，其特征在于，所述新城疫病毒NDV的基因序列见GenBank FJ766530.1；所述HPSE基因的序列如SEQ ID NO:1所示；所述FAP scFv基因的序列如SEQ ID NO:2所示；所述α
‑
1,3 GT基因的序列如SEQ ID NO:3所示。4.如权利要求1
‑
3之任一项所述的重组病毒在融化肿瘤物理屏障中的应用。5.重组新城疫病毒NDV
‑
GHF质粒，其特征在于，其为在新城疫病毒NDV上重组包含α
‑
1,3 GT、HPSE和FAP scFv基因的重组新城疫病毒NDV
‑
GHF质粒；所述重组新城疫病毒NDV
‑
CHF质粒的载体是JS/0704/Pi，所述α
‑
1,3 GT、HPSE和FAP scFv基因插入的位点为Age I、SanD I。6.如权利要求5所述的重组新城疫病毒NDV
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GHF质粒，其特征在于，所述HPSE基因的序列如SEQ ID NO:1所示；所述FAP scFv基因的序列如SEQ ID NO:2所示；所述α
‑
1,3 GT基因的序列如SEQ ID NO:3所示。7.如权利要求5或6所述的重组新城疫病毒NDV
‑
GHF质粒在构建包含重组新城疫病毒NDV
‑
GHF质粒的重组病毒中...

【专利技术属性】
技术研发人员：钟莉娉，
申请(专利权)人：旦旦生物科技上海有限公司，
类型：发明
国别省市：