pSFVCs-EGFP和pSFV-EGFP病毒样颗粒及其制备方法、应用技术

本发明专利技术公开了一种pSFVCs

【技术实现步骤摘要】
pSFVCs
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EGFP和pSFV
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EGFP病毒样颗粒及其制备方法、应用


[0001]本专利技术涉及生物工程
，尤其涉及一种pSFVCs
‑
EGFP和pSFV
‑
EGFP 病毒样颗粒及其制备方法、应用。

技术介绍

[0002]RNA复制子是衍生于RNA病毒基因组并能自主复制的RNA。最常用于开发复制子的病毒是披膜病毒科中的甲病毒(Alphavirus),如辛德比斯病毒 (Sindbis virus,SIN)、塞姆利基森林病毒(Semliki forest virus,SFV)以及委内瑞拉马脑炎病毒(Venezuelan equine encephalitis virus,VEE)；除甲病毒外，还有黄病毒、小RNA病毒、副粘病毒、杯状病毒等。被改造用于RNA复制子疫苗的载体。本专利技术基于甲病毒载体，甲病毒是单股正链RNA 病毒，SFV和SIN 的基因组约12kb，由两个开放读码框架(ORF)组成，靠近5末端的前2/3部分编码非结构蛋白，称为非结构区，该区共编码4种非结构蛋白(nspl—nsp4)；靠近3末端的后1/3部分称为结构区，编码数种结构蛋白，包括衣壳蛋白(C)，膜糖蛋白El、E2、E3以及6K蛋白等。在感染过程中5末端2/3的基因组 RNA首先翻译，产生RNA复制和转录所需要的nSPs。然后在nSPs的作用下，以基因组RNA为模板合成负链，再以负链为模板合成新的基因组RNA分子。结构蛋白由亚基因组mRNA翻译到，亚基因组mRNA沉降系数为26S，因此该亚基因组的启动子命名为P26s。基因组RNA复制得到负链RNA后，由亚基因组启动子P26s启动亚基因组mRNA的转录,并在翻译的同时或之后经病毒和宿主编码蛋白酶的联合作用下而裂解为衣壳蛋白和膜糖蛋白。结构蛋白与先前合成的基因组RNA装配成核衣壳后以出芽方式释放。甲病毒的特点使其可以作为一种基因转移的载体。RNA复制子载体包含病毒基因组3末端的非编码区和非结构蛋白基因编码区，去掉了其结构区，而引入了多克隆位点。在该处插入外源基因之后，可以由26s启动子启动亚基因组mRNA 控制表达。
[0003]表达抗原的RNA复制子可由3种方式递送:(1)体外转录的裸RNA；(2) 构建成质粒DNA由细胞RNA聚合酶Ⅱ体内转录成复制子RNA(基于DNA)；(3)将复制子RNA包装入病毒样颗粒。裸RNA 存在不稳定、降解快、不易储存等缺点,而病毒样颗粒没有感染性,作为免疫原,它可通过和病毒感染一样的途径呈递给免疫细胞,有效地诱导机体的免疫系统产生免疫保护反应,成为良好的疫苗；作为基因治疗载体,可以插入外源蛋白的表位,通过释放外源蛋白达到特异性治疗的目的；由于在细胞表面存在相应受体,既可提高其稳定性还可以增加效率而倍受关注。与其他表达载体相比,SFV复制子表达系统具有宿主范围广、表达效率高等优点，已被广泛用于表达外源基因和构建复制子疫苗以及基因治疗导向载体制备等领域，尤其是在疫苗研究方面，已有病毒和肿瘤复制子候选疫苗进入临床前期及临床试验，显示了其应用前景。
[0004]本专利技术以塞姆利基森林病毒(Semliki forest virus,SFV)为载体，它包括两个独立的RNA分子,一个RNA分子是包含插入了EGFP荧光蛋白基因的RNA 复制子载体。另一个RNA分子是辅助RNA。增强EGFP蛋白的表达，为后续其他重要外源蛋白的筛选和RNA疫苗研制能够提供可靠的实验基础和科学依据，具有重大的意义。然而，如何提高以塞姆利基森林病毒
为载体的EGFP蛋白的表达，目前尚未文献记载。

技术实现思路

[0005]本专利技术所要解决的技术问题在于，其以塞姆利基森林病毒为载体，提供一种pSFVCs
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EGFP和pSFV
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EGFP病毒样颗粒及其制备方法，可以避免融合蛋白的表达，增强了EGFP蛋白的表达。
[0006]本专利技术还要解决的技术问题还在于，提供一种pSFVCs
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EGFP和pSFV
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EGFP 病毒样颗粒的应用。
[0007]为了解决上述技术问题，本专利技术提供了一种pSFVCs
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EGFP病毒样颗粒的制备方法，包括：
[0008](1)设计与合成引物，所述引物包括设计引物Cs
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EGFP
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F和Cs
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EGFP
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R，以及菌液鉴定引物EGFP
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鉴定
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F和EGFP
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鉴定
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R：
[0009](2)以EGFP
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C1为模板，以Cs
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EGFP
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F，Cs
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EGFP
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R为引物扩增Cs
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EGFP 片段，然后经过酶切、同源重组、重组产物转化和鉴定、提取质粒、酶切鉴定及测序，构建得到复制子质粒pSFVCs
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sp6
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EGFP；
[0010](3)将所述复制子质粒pSFVCs
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sp6
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EGFP和辅助质粒SFV
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heleper进行体外转录；
[0011](4)将所述复制子质粒pSFVCs
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sp6
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EGFP及辅助质粒SFV
‑
heleper体外转录的mRNA共电转入BHK细胞中，得到pSFVCs
‑
EGFP病毒样颗粒。
[0012]作为上述技术方案的改进，步骤(1)中，所述引物的序列设计如下：
[0013]Cs
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EGFP
‑
F的序列为SEQ ID NO.1；
[0014]Cs
‑
EGFP
‑
R的序列为SEQ ID NO.2；
[0015]EGFP
‑
鉴定
‑
F的序列为SEQ ID NO.3；
[0016]EGFP
‑
鉴定
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R的序列为SEQ ID NO.4。
[0017]作为上述技术方案的改进，步骤(2)包括：
[0018]以EGFP
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C1为模板，Cs
‑
EGFP
‑
F，Cs
‑
EGFP
‑
R为引物扩增Cs
‑
EGFP片段；
[0019]用BamHI酶切质粒pSFVCs
‑
LacZ，得到酶切载体大片段；
[0020]将所述Cs
‑
EGFP片段和酶切载体大片段同源重组，得到重组产物；
[0021]将重组产物加入到感受态细胞DH5α细胞，进行重组产物转化；
[0022]将转化后的重组产物进行重组产物鉴定本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种pSFVCs
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EGFP病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，包括：(1)设计与合成引物，所述引物包括设计引物Cs
‑
EGFP
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F和Cs
‑
EGFP
‑
R，以及菌液鉴定引物EGFP
‑
鉴定
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F和EGFP
‑
鉴定
‑
R：(2)以EGFP
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C1为模板，以Cs
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EGFP
‑
F，Cs
‑
EGFP
‑
R为引物扩增Cs
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EGFP片段，然后经过酶切、同源重组、重组产物转化和鉴定、提取质粒、酶切鉴定及测序，构建得到复制子质粒pSFVCs
‑
sp6
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EGFP；(3)将所述复制子质粒pSFVCs
‑
sp6
‑
EGFP和辅助质粒SFV
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heleper进行体外转录；(4)将所述复制子质粒pSFVCs
‑
sp6
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EGFP及辅助质粒SFV
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heleper体外转录的mRNA共电转入BHK细胞中，得到pSFVCs
‑
EGFP病毒样颗粒。2.如权利要求1所述的pSFVCs
‑
EGFP病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述引物的序列如下所示：Cs
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EGFP
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F的序列为SEQ ID NO.1；Cs
‑
EGFP
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R的序列为SEQ ID NO.2；EGFP
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鉴定
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F的序列为SEQ ID NO.3；EGFP
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鉴定
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R的序列为SEQ ID NO.4。3.如权利要求2所述的pSFVCs
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EGFP病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，步骤(2)包括：以EGFP
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C1为模板，Cs
‑
EGFP
‑
F，Cs
‑
EGFP
‑
R为引物扩增Cs
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EGFP片段；用BamHI酶切质粒pSFVCs
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LacZ，得到酶切载体大片段；将所述Cs
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EGFP片段和酶切载体大片段同源重组，得到重组产物；将重组产物加入到感受态细胞DH5α细胞，进行重组产物转化；将转化后的重组产物进行重组产物鉴定；将鉴定后的重组产物提取质粒；对所述质粒进行酶切鉴定及测序。4.如权利要求3所述的pSFVCs
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EGFP病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，步骤(3)包括：线性化所述复制子质粒pSFVCs
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sp6
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EGFP及辅助质粒SFV
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heleper；将线性化后的复制子质粒pSFVCs
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sp6
‑
EGFP及辅助质粒SFV
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heleper进行体外转录。5.一种pSFVCs

【专利技术属性】
技术研发人员：方倪冉，黄梅，温良海，徐婷，杨斌，
申请(专利权)人：华农肇庆生物产业技术研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：