本发明专利技术提供了可受微小RNA调控的分离的重组溶瘤痘病毒及其应用。所述分离的重组溶瘤痘病毒能够受微小RNA调控，所述微小RNA的表达量在哺乳动物的肿瘤细胞中比在同种哺乳动物的正常细胞中低，其中该重组溶瘤痘病毒基因组中的E10R基因的3
【技术实现步骤摘要】
122、miR-124、miR-125a、miR-125b、miR-126、miR-127、miR-128、miR-133b、miR-139、miR-140、miR-142、miR-143、miR-145、miR-181、miR-192、miR-195、miR-198、miR-199a、miR-199b、miR-200、miR-203、miR-204、miR-205、miR-218、miR-219、miR-220、miR-224、miR-345、miR-375；优选miR-199a和miR-199b。
[0009](3)根据(1)所述的重组溶瘤痘病毒，该重组溶瘤痘病毒是TK基因功能缺陷型的和/或VGF基因功能缺陷型的。
[0010](4)根据(1)所述的重组溶瘤痘病毒，其中所述微小RNA的所述靶序列是重复的，所述重复包含2-8个重复。
[0011](5)根据(3)所述的重组溶瘤痘病毒，其中所述重组溶瘤痘病毒的基因组中整合有外源IL-21基因，并且该IL-21基因能够在肿瘤细胞中表达。
[0012](6)根据(3)所述的重组溶瘤痘病毒，其中所述TK基因通过插入外源核苷酸序列而使该TK基因功能缺陷。
[0013](7)根据(5)所述的重组溶瘤痘病毒，其中所述外源IL-21基因插入在所述TK基因中，从而使该TK基因功能缺陷。
[0014](8)根据(3)所述的重组溶瘤痘病毒，其中所述VGF基因通过基因敲除或插入外源核苷酸序列而使该VGF基因功能缺陷。
[0015](9)根据(1)所述的重组溶瘤痘病毒，其中所述重组溶瘤痘病毒是WR株或惠氏株。
[0016](10)根据(1)所述的重组溶瘤痘病毒，其中所述重组溶瘤痘病毒的基因组中还整合有外源筛选基因，所述外源筛选基因包括gpt基因和/或LacZ基因。
[0017](11)根据(5)所述的重组溶瘤痘病毒，其中所述外源IL-21基因来自于小鼠或人。
[0018](12)一种药物组合物，其中该药物组合物包括作为活性成分的根据(1)-(11)中任一项所述的重组溶瘤痘病毒，及可药用辅料。
[0019](13)根据(12)所述的药物组合物，其中所述药物组合物包含1
×
10
5-5
×
109pfu的所述重组溶瘤痘病毒。
[0020](14)根据(12)所述的药物组合物，其中所述重组溶瘤痘病毒通过瘤内注射给药或静脉给药。
[0021](15)一种用于制备(1)-(11)中任一项所述的重组溶瘤痘病毒的载体。
[0022](16)根据(15)所述的载体，其中所述载体包含在启动子控制下的外源IL-21基因。
[0023](17)一种含有(15)或(16)所述的载体的宿主细胞。
[0024](18)根据(1)-(11)中任一项所述的重组溶瘤痘病毒在制备用于治疗肿瘤和/或癌症的药物中的用途。
[0025](19)根据(18)所述的用途，其中所述肿瘤和/或癌症包括肺癌、黑色素瘤、头颈部癌症、肝癌、颅内肿瘤、结直肠癌、膀胱癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、宫颈癌、胃癌、食道癌、肾癌、前列腺癌、胰腺癌、淋巴癌、白血病、骨癌、睾丸癌、骨肉瘤。
[0026](20)一种治疗肿瘤和/或癌症的方法，包括对肿瘤和/或癌症患者施用根据(1)-(11)中任一项所述的重组溶瘤痘病毒。
[0027](21)根据权利要求20所述的方法，其中所述重组溶瘤痘病毒的施用剂量为1
×
10
5-5
×
109pfu，每天1次，连续施用1-6天；或每2天1次，连续施用1-6次。
[0028](22)根据(20)所述的方法，其中所述溶瘤病毒通过瘤内注射给药或静脉给药。
[0029](23)根据(20)所述的方法，其中所述肿瘤和/或癌症包括肺癌、黑色素瘤、头颈部癌症、肝癌、颅内肿瘤、结直肠癌、膀胱癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、宫颈癌、胃癌、食道癌、肾癌、前列腺癌、胰腺癌、淋巴癌、白血病、骨癌、睾丸癌、骨肉瘤。
[0030]本专利技术与现有技术相比具有以下优点和积极效果：
[0031]经过深入的研究和实验，本专利技术在溶瘤痘病毒的基因组中选择出特定的必需基因E10R，并提出在E10R的3
’
UTR区(3
’
非翻译区)插入外源核苷酸序列，该外源核苷酸序列包含特定微小RNA的靶序列，其中所述微小RNA的表达量在肿瘤细胞中比在正常细胞中低。这样在感染该溶瘤痘病毒的正常细胞中，高表达的所述微小RNA能够靶定到所述溶瘤痘病毒E10R的3
’
UTR区对应的mRNA，通过降解mRNA或阻碍其翻译，来抑制E10R的表达，从而抑制所述溶瘤痘病毒的复制。而在感染该溶瘤痘病毒的肿瘤细胞中所述微小RNA低表达或不表达，因而E10R的表达不被抑制，从而保持所述溶瘤痘病毒的复制能力。因此本专利技术利用体内正常组织与肿瘤组织内特定微小RNA表达量不同的特点，来提供一种对肿瘤细胞具有更高、更明显的选择性的新型重组溶瘤痘病毒。本专利技术人惊奇地发现，本专利技术的重组溶瘤痘病毒在多种肿瘤细胞中的复制均明显高于正常细胞，从而具有更好的肿瘤特异性、安全性，并且能够显著抑制肿瘤细胞的生长。
[0032]此外，本专利技术进一步选择了微小RNA的种类，发现多种微小RNA(优选miR-199)能够有效地实现本专利技术的目的，所得重组溶瘤痘病毒显示了更强的肿瘤选择性和安全性。
[0033]本专利技术的新型重组溶瘤痘病毒可进一步包括TK和/或VGF基因失活，从而实现了更强的肿瘤细胞选择性，与已有的溶瘤痘病毒(例如TK和/或VGF缺陷痘病毒)相比，其在正常细胞中的复制及对正常细胞的杀伤显著降低。
[0034]此外，本专利技术进一步使所述新型溶瘤痘病毒同时携带免疫调控因子IL-21的基因，从而使所得的重组溶瘤痘病毒能够选择性地在肿瘤细胞中复制，并且表达免疫调控因子IL-21。这样能够充分发挥溶瘤病毒选择性地在肿瘤细胞中复制并杀死肿瘤细胞、以及进一步引起随后的机体免疫反应的作用，同时还能够充分发挥外源IL-21的抗肿瘤免疫作用。本专利技术发现在溶瘤痘病毒中整合IL-21基因，能够使溶瘤病毒的溶瘤杀伤作用和IL-21的抗肿瘤免疫刺激作用产生协同效果。
[0035]由此，本专利技术为癌症治疗提供了更加丰富和有效的产品线，能够提供效果更好、肿瘤特异性更高、更加安全的产品。
附图说明
[0036]图1示出制备例1中质粒pZB-E10R-miR199T构建流程图。
[0037]图2示出制备例1中pZB-E10R-miR199T质粒的鉴定结果；其中泳道M为DNA Marker III(DNA分子量标记III)，泳道1为pZB-E10R-miR199T条带。
[0038]图3示出制备例2中构建的VSC20-mT/mCherry骨架病毒的单克隆重组溶瘤病毒鉴定结果；其中M泳道为DNA分子量标记，泳道1为VSC20-mT/mCherry条带，泳道2为VSC20本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种分离的重组溶瘤痘病毒，该重组溶瘤痘病毒能够受微小RNA调控，所述微小RNA的表达量在哺乳动物的肿瘤细胞中比在同种哺乳动物的正常细胞中低，其中该重组溶瘤痘病毒基因组中的E10R基因的3
’
UTR区域中整合有所述微小RNA的靶序列。2.根据权利要求1所述的重组溶瘤痘病毒，其中所述微小RNA选自：miR-9、miR-15a、miR-16、miR-26a、miR-27b、miR-29b、miR-30a、miR-32、miR-33、miR-34、miR-95、miR-101、miR-122、miR-124、miR-125a、miR-125b、miR-126、miR-127、miR-128、miR-133b、miR-139、miR-140、miR-142、miR-143、miR-145、miR-181、miR-192、miR-195、miR-198、miR-199a、miR-199b、miR-200、miR-203、miR-204、miR-205、miR-218、miR-219、miR-220、miR-224、miR-345、miR-375；优选miR-199a和miR-199b。3.根据权利要求1所述的重组溶瘤痘病毒，该重组溶瘤痘病毒是TK基因功能缺陷型的和/或VGF基因功能缺陷型的。4.根据权利要求1所述的重组溶瘤痘病毒，其中所述微小RNA的所述靶序列是重复的，所述重复包含2-8个重复。5.根据权利要求3所述的重组溶瘤痘病毒，其中所述重组溶瘤痘病毒的基因组中整合有外源IL-21基因，并且该IL-21基因能够在肿瘤细胞中表达。6.根据权利要求3所述的重组溶瘤痘病毒，其中所述TK基因通过插入外源核苷酸序列而使该TK基因功能缺陷。7.根据权利要求5所述的重组溶瘤痘病毒，其中所述外源IL-21基因插入在所述TK基因中，从而使该TK基因功能缺陷。8.根据权利要求3所述的重组溶瘤痘病毒，其中所述VGF基因通过基因敲除或插入外源核苷酸序列而使该VGF基因功能缺陷。9.根据权利要求1所述的重组溶瘤痘病毒，其中所述重组溶瘤痘病毒是WR株或惠氏株。10.根据权利要求1所述的...
【专利技术属性】
技术研发人员：傅瑾，张蓉，王婷婷，秦云，方吴敏，胡放，阎辉，
申请(专利权)人：杭州康万达医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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