一种靶向性双展示噬菌体及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种靶向性双展示噬菌体及其制备方法和应用，属于DNA重组技术领域。本发明专利技术公开的一种靶向性双展示噬菌体，利用噬菌体展示技术将编码P53蛋白N端表位多肽SV及DP分别定向克隆到丝状噬菌体的PIII及PVIII基因中，制备出尾部PIII蛋白展示肽SV、背部PVIII蛋白展示肽DP的靶向性双展示噬菌体phage

【技术实现步骤摘要】
一种靶向性双展示噬菌体及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及DNA重组
，更具体的说是涉及一种靶向性双展示噬菌体及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]癌症是威胁人类健康的主要杀手，在我国每年癌症发病人数约260万，死亡约180万。导致这一现象的原因很多，其中一个重要的原因是目前人类还不能对肿瘤的发生发展过程进行有效的诊断，尤其是早期诊断。
[0003]p53是一种抑癌基因，其蛋白对维持正常的细胞分裂与生长起重要的调节作用，但是一旦该基因发生突变，其编码的突变蛋白半衰期延长，失去抑癌作用，积累于细胞内并刺激免疫系统产生P53抗体。研究表明，血清P53抗体可以作为一种广谱性的肿瘤标志物用于肿瘤早期检测和肿瘤高危人群的筛查。
[0004]目前，血清P53抗体的检测主要以重组P53蛋白为基础开展，而蛋白的制备及纯化具有操作繁琐、费时、价格相对昂贵且灵敏度低等缺点。
[0005]因此，提供一种靶向性双展示噬菌体及其制备方法和应用是本领域技术人员亟需解决的问题。

技术实现思路

[0006]有鉴于此，本专利技术提供了一种能够用于肿瘤患者血清P53抗体检测的靶向性双展示噬菌体，该噬菌体作为一种新型生物制品具有特异性强、灵敏度高、制备简单、成本低廉等优点。
[0007]为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0008]一种靶向性双展示噬菌体，利用噬菌体展示技术将编码P53蛋白N端表位多肽SV及DP分别定向克隆到丝状噬菌体的PIII及PVIII基因中，制备出尾部PIII蛋白展示肽SV、背部PVIII蛋白展示肽DP的靶向性双展示噬菌体phage
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SV
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DP；所述SV的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述DP的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。
[0009]进一步，所述的一种靶向性双展示噬菌体的制备方法，具体步骤如下：
[0010]1)构建重组噬菌体载体fADL
‑
le
‑
SV
[0011](1)BglI酶切载体fADL
‑
le，获得酶切后的载体fADL
‑
le；
[0012](2)合成P53蛋白N端表位多肽SV；
[0013](3)将步骤(1)酶切后的载体fADL
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le与步骤(2)合成的SV连接，转化，筛选阳性克隆，获得重组噬菌体载体fADL
‑
le
‑
SV；
[0014]2)构建重组噬菌体载体fADL
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le
‑
SV
‑
DP
[0015]以构建好的噬菌体载体fADL
‑
le
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SV为模板，利用点突变试剂盒将肽DP定向克隆到噬菌体的PVIII基因中，构建获得重组噬菌体载体fADL
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le
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SV
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DP；
[0016]3)制备噬菌体phage
‑
SV
‑
DP
[0017](1)将转化有重组噬菌体载体fADL
‑
le
‑
SV
‑
DP的菌株接种到含有Kar
+
的LB液体培养基中，37℃剧烈震荡10h；
[0018](2)8000rpm，10min，4℃，留上清；
[0019](3)加入六分之一体积的PEG/NaCl溶液，涡旋，4℃过夜；
[0020](4)12000rpm离心15min，用1ml TBS溶解噬菌体沉淀；
[0021](5)将溶液转移至1.5ml EP管中，14000rpm离心1min，小心将上清转移至1.5ml EP管中，每个EP管中加入150μl PEG/NaCl，混匀后4℃过夜；
[0022](6)14000rpm离心15min，用100μl TBS溶解噬菌体沉淀，4℃冰箱保存。
[0023]进一步，所述的靶向性双展示噬菌体在检测血清P53抗体中的应用。
[0024]噬菌体展示技术能够将基因型与表现型联系起来，使研究者可以在基因水平上实现对蛋白质构象的体外控制，在体外获得具有良好生物学活性的表达产物。
[0025]经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本专利技术公开提供了一种靶向性双展示噬菌体及其制备方法和应用，利用噬菌体展示技术得到了一种次要外壳蛋白(PIII)展示p53蛋白表位多肽SV、主要外壳蛋白(PVIII)展示p53蛋白表位多肽DP的靶向性双展示噬菌体phage
‑
SV
‑
DP；该噬菌体作为一种新型生物制品，具有特异性强、灵敏度高、制备简单、成本低廉等优点，能够应用于肿瘤患者血清P53抗体的检测。
附图说明
[0026]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
[0027]图1附图为本专利技术靶向性双展示噬菌体phage
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SV
‑
DP制备过程示意图；
[0028]图2附图为本专利技术噬菌体载体fADL
‑
le的图谱；
[0029]图3附图为本专利技术fADL
‑
le载体Bgl I酶切结果；
[0030]其中，1，Marker；2，fADL
‑
le载体；3，fADL
‑
le载体BglI酶切后；
[0031]图4附图为本专利技术PCR验证重组载体fADL
‑
le
‑
SV阳性克隆；
[0032]其中，1，Marker；2
‑
5，阳性克隆；
[0033]图5附图为本专利技术重组噬菌体载体fADL
‑
le
‑
SV部分测序峰图；第884
‑
919为编码目标多肽的核苷酸序列；
[0034]图6附图为本专利技术重组噬菌体载体fADL
‑
le
‑
SV
‑
DP PVIII位点部分测序峰图；第505
‑
534为编码目标多肽的核苷酸序列；
[0035]图7附图为本专利技术Westernblot分析靶向性双展示噬菌体phage
‑
SV
‑
DP；
[0036]其中，1，Marker；2，辅助噬菌体M13K07与P53多克隆抗体杂交(阴性对照)；3，phage
‑
DP与P53多克隆抗体杂交；4，phage
‑
SV
‑
DP与P53多克隆抗体杂交；
[00本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种靶向性双展示噬菌体，其特征在于，利用噬菌体展示技术将编码P53蛋白N端表位多肽SV及DP分别定向克隆到丝状噬菌体的PIII及PVIII基因中，制备出尾部PIII蛋白展示肽SV、背部PVIII蛋白展示肽DP的靶向性双展示噬菌体phage
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SV
‑
DP；所述SV的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述DP的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。2.根据权利要求1所述的一种靶向性双展示噬菌体的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：1)构建重组噬菌体载体fADL
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le
‑
SV(1)BglI酶切载体fADL
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le，获得酶切后的载体fADL
‑
le；(2)合成P53蛋白N端表位多肽SV；(3)将步骤(1)酶切后的载体fADL
‑
le与步骤(2)合成的SV连接，转化，筛选阳性克隆，获得重组噬菌体载体fADL
‑
le
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SV；2)构建重组噬菌体载体fADL
‑
le
‑
SV
‑
DP以构建好的噬菌体载体...

【专利技术属性】
技术研发人员：潘鹏涛，常明杰，邹凡雨，王选年，杨祎洁，孙国鹏，李鹏，郭冬光，李梦阳，孙梦月，
申请(专利权)人：新乡学院，
类型：发明
国别省市：