包含外源抗原的人巨细胞病毒制造技术

本发明专利技术涉及包含外源抗原的人巨细胞病毒.公开了包含异源抗原的人巨细胞病毒载体.来源于TR毒株的载体是更昔洛韦敏感的，包含活性US2、US3、US6、US7和UL131A基因，并且在UL82基因中具有阻止pp71表达的有害或失活突变。因中具有阻止pp71表达的有害或失活突变。因中具有阻止pp71表达的有害或失活突变。

【技术实现步骤摘要】
包含外源抗原的人巨细胞病毒
[0001]本申请是申请号为201580045987.1的中国专利申请的分案申请，原申请是2015年7月16日提交的PCT国际申请PCT/US2015/040807于2017 年2月27日进入中国国家阶段的申请.
[0002]相关申请的交叉引用
[0003]本申请要求于2014年7月16日提交的题为HUMAN CYTOMEGALOVIRUS COMPRIZING EXOGENOUS ANTIGENS的美国临时申请No.62/025,348的优先权，其公开内容通过引用整体并入本文.


[0004]总体来说，所述领域涉及疫苗平台.更具体地，所述领域涉及表达外源抗原的重组人巨细胞病毒载体.

技术介绍

[0005]动物实验已经证明，载有巨细胞病毒(CMV)的疫苗是独特的，因为它们：a)诱导并维持高频率的超淋巴样T细胞(extralymphoid T cell)应答(所谓的效应记忆性T细胞)；b)超感染CMV阳性宿主；以及c)即使当宿主向宿主(host
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to
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host)扩散缺陷时仍保持免疫原性.此外，动物模型中的实验已经表明，来源于动物CMV的疫苗载体诱导针对感染性疾病和癌症的保护性免疫应答(US 20080199493；US 20100142823；US20130136768和US 20140141038；所有这些通过引用并入本文).特别引人注目的是以下发现：载有恒河猴CMV(RhCMV)的猴免疫缺陷病毒(S1V)疫苗不仅能够预防非人灵长类动物中的AIDS，而且能够最终治愈这些动物的SIV(Hansen SG等，Nature 502，100
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104(2013)；通过引用并入本文)。
[0006]在巨细胞病毒疫苗的开发中使用减毒株(attenuated strain)是重要的，因为未弱化的毒株可以从宿主向宿主扩散，并且至少在免疫受损个体中可能是病理性的.之前，弱化的人CMV(HCMV)毒株未能a)建立潜伏感染(Plotkin SA和Huang ES，J Infect Dis 152，395
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397(1985)；通过引用并入本文)；b)诱导长持续时间的免疫力(Jacobson MA等，J Clin Virol 35，332
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337(2006)；通过引用并入本文)；c)再次感染显著比例的之前已被CMV天然感染过的群体(Heineman TC等，JInfect Dis 193，1350
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1360(2006)，通过引用并入本文)；或d)产生持续感染(WO2013/036465，通过引用并入本文).此外，当在成纤维细胞中生长时，HCMV基因组的临床毒株在体外高度不稳定，导致成纤维细胞适应(adaptation)，例如UL131A的缺失.
[0007]这样的适应对组织培养物在体内执行载体功能能力的影响大多是未知的.除了需要弱化以在体外和体内稳定之外，重要的是这些载体可以被制造为具有可重现的结果。最稳定的弱化策略是基因缺失.然而，这通常需要产生互补细胞系(complementing cell line)，这对用于生长巨细胞病毒的原代细胞来说是难以实现的.

技术实现思路

[0008]本文公开了来自HCMV
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TR3的严重弱化、扩散缺陷(即，细胞向细胞扩散缺陷)的载体，HCMV
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TR3是HCMV TR毒株的遗传修饰形式. 所公开的载体建立并维持持续感染，诱导并维持针对异源抗原的效应记忆 T细胞，并再次感染CMV血清阳性宿主.所述载体包含异源抗原，例如非CMV病原体特异性抗原或肿瘤抗原.
[0009]特别地，将TR3工程化为更昔洛韦敏感的.在一个实例中，这是由于添加了活性UL97基因(其在TR3的原始临床分离株中突变)。将TR3 进一步工程化以包含活性US2、US3、US6和US7基因，这些基因在TR3 的原始临床分离株的BAC克隆期间被移除。TR3的另外的形式包括编码 pp71之UL82基因中的有害(即失活)突变，其在本文中可以称为 TR3Δpp71或另称为TR3ΔUL82.
[0010]在载体的另一些实例中，编码异源抗原的基因的表达可以由UL82启动子或另一种病毒启动子如UL7、UL38、UL45或US13启动子驱动.在另一些实例中，可以插入编码异源抗原的多个基因来代替UL82和另一种病毒基因如UL7、UL38、UL45或US13，以使得病毒基因启动子驱动异源抗原基因的表达.
[0011]本文还公开了产生缺少功能性pp71蛋白(由UL82基因编码)的 HCMV的方法.所述方法涉及用缺少功能性pp71蛋白的HCMV感染细胞，其中所述细胞包含使DAXX基因沉默的siRNA.在另一些实施方案中，所述方法涉及用缺少功能性pp71蛋白的HCMV感染细胞，其中通过本领域已知的其他技术使细胞中DAXX基因的表达在蛋白质或RNA水平下调，例如通过RNA干扰(如微小RNA打靶和短发夹RNA(shRNA)打靶)、核酶切割、通过条件或诱导型启动子调节的表达、DAXX结合蛋白的表达，或靶向用于泛素化和降解的DAXX或DAXX蛋白复合物.使用这些方法，有效地产生HCMV而不需要互补。细胞可以是任何细胞，包括人成纤维细胞.
附图说明
[0012]本文中的一些附图在以彩色呈现时更好理解，这在专利申请公开中不可用。然而，申请人认为彩色附图是原始公开的一部分，并且保留在后面的程序中呈现本文附图的彩色版本的权利.
[0013]图1A和1B共同显示，与其他HCMV毒株相比，HCMV TR在建立潜伏期和从潜伏期再活化(+G
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CSF)方面更优越。图1A是在图1B中使用的HCMV克隆的基因组结构的图.HCMV基因组的侧翼是使长独特序列(unique long，UL)区和短独特序列(unique short，US)区分离的末端重复(TRL和TRS，如所示)和内部重复(IRS).每个构建体中BAC 盒的位置由标识为B的区域指示.由于BAC盒的插入，HCMV TR的 US区域缺少US2
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7.除缺少US2
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7外，TRΔ4缺少基因UL128
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UL150。 UL131A基因在AD169中缺陷，但在AD169 BAD UL131A中被修复(Wang和Schenk，2005，下文)。Toledo具有UL133
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128区域的倒置，在UL128中具有缺失(Murphy等，2003下文).图1B是总结了植入有人CD34+干细胞并用指定HCMV毒株感染的人成纤维细胞腹膜内接种的 NOD/SCID/IL2Rγ
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null(NSG)小鼠的结果的图.感染后4周，通过粒细胞集落刺激因子(G
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CSF)处理动员人造血干细胞，并通过定量PCR在肝中测量病毒载量.
[0014]图2是HCMV
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TR3基因组的图示本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.重组人巨细胞病毒(HCMV)，其包含：(1)编码至少一种异源抗原的核酸；(2)UL78基因、UL45基因或US13基因中的失活突变；和(3)活性US2、US3、US6、US7、UL97和UL131A基因；其中所述重组HCMV是遗传修饰的HCMV的TR毒株；并且其中所述重组HCMV是更昔洛韦敏感的。2.权利要求1的重组HCMV，其中所述活性US2、US3、US6和US7基因来源于HCMV的AD169毒株。3.权利要求1的重组HCMV，其中所述编码至少一种异源抗原的核酸的表达由UL82启动子、UL7启动子、UL45启动子、UL78启动子或US13启动子驱动。4.权利要求1的重组HCMV，其中UL78基因中的失活突变是UL78基因的全部或部分缺失。5.权利要求4的重组HCMV，其中所述编码至少一种异源抗原的核酸替代UL78基因的全部或部分。6.权利要求5的重组HCMV，其中替代UL78基因的全部或部分的所述编码至少一种异源抗原的核酸的表达由UL78启动子驱动。7.权利要求1的重组HCMV，其中UL45基因中的失活突变是UL45基因的全部或部分缺失。8.权利要求7的重组HCMV，其中所述编码至少一种异源抗原的核酸替代UL45基因的全部或部分。9.权利要求8的重组HCMV，其中替代UL45基因的全部或部分的所述编码至少一种异源抗原的核酸的表达由UL45基因启动子驱动。10.权利要求1的重组HCMV，其中US13基因中的失活突变是US13基因的全部或部分缺失。11.权利要求10的重组HCMV，其中所述编码至少一种异源抗原的核酸替代US13基因的全部或部分。12.权利要求11的重组HCMV，其中替代US13基因的全部或部分的所述编码至少一种异源抗原的核酸的表达由US13基因启动子驱动。13.权利要求1的重组HCMV，其还包含UL7或UL38HCMV基因中的失活突变。14.权利要求1的重组HCMV，其还包含UL7基因中的失活突变，其中UL7基因中的失活突变是UL7基因的全部或部分缺失。15.权利要求14的重组HCMV，其中所述编码至少一种异源抗原的核酸替代UL7基因的全部或部分。16.权利要求15的重组HCMV，其中替代UL7基因的全部或部分的所述编码至少一种异源抗原的核酸的表达由UL7启动子驱动。17.权利要求1的重组HCMV，其还包含UL38基因中的失活突变，并且所述失活突变是UL38基因的全部或部分缺失。.18.权利要求17的重组HCMV，其中所述编码至少一种异源抗原的核酸替代UL38基因的全部或部分。19.权利要求18的重组HCMV，其中替代UL38基因的全部或部分的所述编码至少一种异源抗原的核酸的表达由UL38启动子驱动。
20.权利要求1的重组HCMV，其还包含UL128基因或UL130基因中的失活突变。21.权利要求1的重组HCM...

【专利技术属性】
技术研发人员：克劳斯，
申请(专利权)人：俄勒冈健康与科学大学，
类型：发明
国别省市：