表达禽传染性支气管炎病毒S蛋白重组新城疫载体疫苗、制备方法及应用技术

本发明专利技术属于生物技术领域，尤其涉及表达禽传染性支气管炎病毒S蛋白重组新城疫载体疫苗、制备方法及应用。本发明专利技术采用反向遗传操作技术将编码IBV S蛋白基因以不同形式插入热稳定新城疫疫苗毒株(rTS09

【技术实现步骤摘要】
表达禽传染性支气管炎病毒S蛋白重组新城疫载体疫苗、制备方法及应用


[0001]本专利技术属于生物
，尤其涉及表达禽传染性支气管炎病毒S蛋白重组新城疫载体疫苗、制备方法及应用。

技术介绍

[0002]目前，对禽类养殖业危害最为严重的两类疫病是新城疫(Newcastle disease,ND)与高致病性禽流感(high pathogenic avian influenza,HPAI)。此外，由于鸡传染性支气管炎(infectious bronchitis,IB)的影响范围也逐渐扩大，近年来引起人们对该禽类病毒的高度关注。新城疫、高致病性禽流感和鸡传染性支气管炎分别是由新城疫病毒(Newcatle disease virus,NDV)、高致病性禽流感病毒(high pathogenic avian influenza virus,HPAIV)和传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)感染禽类引起的烈性传染性疫病。
[0003]新城疫(ND)是一种多禽类发生的、急性的、高接触性且高死亡率的疫病。ND的爆发往往对家禽养殖业造成巨大的经济损失。目前，ND的防控主要为免疫预防。新城疫病毒(NDV)属于副黏病毒科(Paramyxoviridae)、副黏病毒亚科(Paramyxovirinae)、禽腮腺炎病毒属(Avulavirus)。该病毒具有囊膜结构，且囊膜表面有纤突；NDV的基因组为单股负链RNA，长约为15kb。由于NDV能够有效地诱导机体产生强烈的免疫应答，可通过反向遗传学的方法对其改造，并将其设计构建为疫苗载体。作为一种新型疫苗，新城疫病毒载体疫苗与传统疫苗相比，具有诸多优势及良好的应用前景，是当今和未来疫苗研究开发的重要研究方案之一。
[0004]传染性支气管炎病毒(infectious bronchitis virus，IBV)感染导致禽类的急性高度接触传染性疾病，通常会引起家禽的肾脏及呼吸道损伤，给家禽养殖业造成巨大损失。纤突蛋白(Spike protein,S)是传染性支气管炎病毒的最重要的结构蛋白，构成病毒纤突。S蛋白包含S1和S2两个亚基，均属于糖蛋白，其中，S1蛋白对病毒毒力、组织嗜性和血清型起到决定性作用，并能够诱导宿主产生体液及细胞免疫应答，在载体疫苗和亚单位疫苗的研究中具有重要意义。
[0005]传染性支气管炎病毒包含多种血清型，不同血清型间不具有交叉保护效果，因此，设计一种能够诱导对多种血清型IBV毒株产生保护作用的疫苗在IBV疫苗研发中具有重要意义。

技术实现思路

[0006]针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了表达禽传染性支气管炎病毒S蛋白重组新城疫载体疫苗、制备方法及应用，目的在于解决现有技术中的问题或至少解决现有技术中的一部分问题。
[0007]本申请采用反向遗传操作技术策略将传染性支气管炎病毒S蛋白以不同形式插入
热稳定新城疫疫苗株基因组，构建筛选获得四株重组新城疫载体疫苗毒株。重组载体疫苗病毒特性研究证实，所构建的四株均具有耐热、低毒、遗传稳定和高效表达外源抗原蛋白；SPF鸡免疫与感染实验证实，四株重组新城疫载体疫苗免疫均能诱导产生特异性免疫应答和抗NDV和IBV强毒株感染的免疫保护。重要的是，将IBV的tS1与N蛋白包含T细胞表位的肽段融合表达能显著增强rTS
‑
tS1/Nd毒株诱导的IBV特异性细胞免疫应答水平和提供免疫鸡针对IBV强毒株攻毒感染的免疫保护。本申请的研究技术为发展基于热稳定新城疫疫苗株为载体的重组新城疫载体双价或多价疫苗提供了新思路和有益借鉴。
[0008]本专利技术是这样实现的，表达禽传染性支气管炎病毒S蛋白重组新城疫载体疫苗的制备方法，其特征在于：以新城疫热稳定疫苗rTS09
‑
C株为材料，通过反向遗传操作将传染性支气管炎病毒S蛋白插入rTS09
‑
C基因组的P和M基因之间，拯救获得重组新城疫载体疫苗；
[0009]所述传染性支气管炎病毒S蛋白为如SEQ ID NO.1所示的完整的S蛋白，或如SEQ ID NO.2所示的S1蛋白，或如SEQ ID NO.3所示的tS1蛋白，或如SEQ ID NO.4所示的tS1/Nd蛋白。
[0010]进一步地，利用引物对载体质粒pTS09
‑
C进行扩增，得到线性化后的目的载体片段；
[0011]利用引物序列分别扩增SEQ ID NO.1
‑
3和SEQ ID NO.5所示的序列得到S、S1、tS1和Nd片段；将tS1片段和Nd片段通过重叠延伸的方式连接，组成tS1/Nd片段；
[0012]分别连接目的片段和载体，得到质粒pTS
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S、pTS
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S1、pTS
‑
tS1和pTS
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tS1/Nd；
[0013]经过病毒拯救，分别得到重组新城疫载体疫苗rTS
‑
S、rTS
‑
S1、rTS
‑
tS1和rTS
‑
tS1/Nd。
[0014]进一步地，利用如SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.15所示的引物序列对载体质粒pTS09
‑
C进行扩增。
[0015]进一步地，利用如SEQ ID NO.6
‑
SEQ ID NO.13所示的引物序列分别扩增得到S、S1、tS1和Nd片段。
[0016]进一步地，使用同源重组酶In
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fusion酶连接目的片段和载体。
[0017]本专利技术还提供了利用上述的表达禽传染性支气管炎病毒S蛋白重组新城疫载体疫苗的制备方法制备的重组新城疫载体疫苗。
[0018]本专利技术还提供了如上述的重组新城疫载体疫苗在制备诱导机体产生针对新城疫病毒和/或传染性支气管炎病毒的特异性免疫应答功能的试剂中的应用。
[0019]进一步地，所述特异性免疫应答包括诱导机体产生相应抗体。
[0020]进一步地，所述特异性免疫应答包括调控机体IFN
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γ的含量。
[0021]本专利技术对IBV的S蛋白进行了一定的修饰，修饰方式包括截断选用S1蛋白、将信号肽替换为tPA信号肽、添加Nd肽段。利用反向遗传操作技术将修饰后的S基因及S1基因等插入了之前设计好的新城疫疫苗rTS09
‑
C株骨架中，通过RT
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PCR及透视电镜等技术证明，本申请成功拯救了重组病毒，且重组病毒能够稳定表达插入的外源片段，相关病毒特性实验验证表明，重组病毒具有与亲本株相似的低毒、热稳定的病毒特性。
[0022]根据免疫及攻毒实验的结果来看，重组新城疫载体疫苗能够对两种病毒的强毒株攻毒产生100％的保护效果，此外，四种重组新城疫载体疫苗均能够减少两种病毒的排毒，
并降低传染性支气管炎病毒对鸡气管的损伤。
[0023]本申请中将Nd片段接入S1蛋本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.表达禽传染性支气管炎病毒S蛋白重组新城疫载体疫苗的制备方法，其特征在于：以新城疫热稳定疫苗rTS09
‑
C株为材料，通过反向遗传操作将传染性支气管炎病毒S蛋白插入rTS09
‑
C基因组的P和M基因之间，拯救获得重组新城疫载体疫苗；所述传染性支气管炎病毒S蛋白为如SEQ ID NO.1所示的完整的S蛋白，或如SEQ ID NO.2所示的S1蛋白，或如SEQ ID NO.3所示的tS1蛋白，或如SEQ ID NO.4所示的tS1/Nd蛋白。2.根据权利要求1所述的表达禽传染性支气管炎病毒S蛋白重组新城疫载体疫苗的制备方法，其特征在于：利用引物对载体质粒pTS09
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C进行扩增，得到线性化后的目的载体片段；利用引物序列分别扩增SEQ ID NO.1
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3和SEQ ID NO.5所示的序列得到S、S1、tS1和Nd片段；将tS1片段和Nd片段通过重叠延伸的方式连接，组成tS1/Nd片段；分别连接目的片段和载体，得到质粒pTS
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S、pTS
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S1、pTS
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tS1和pTS
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tS1/Nd；经过病毒拯救，分别得到重组新城疫载体疫苗rTS
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S、rTS
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S1、...

【专利技术属性】
技术研发人员：潘兹书，许路来，温国元，
申请(专利权)人：武汉大学，
类型：发明
国别省市：