本发明专利技术涉及一种重组新城疫病毒及制备方法、重组质粒、及其应用。该重组新城疫病毒，将新城疫病毒Losata的F蛋白替换为新城疫病毒强毒株的F蛋白而获得。本发明专利技术的重组嵌合病毒能有效抑制肿瘤细胞，促进肿瘤细胞的凋亡，有效地治疗肿瘤，并且具有良好的安全性。并且具有良好的安全性。并且具有良好的安全性。
【技术实现步骤摘要】
重组新城疫病毒及制备方法、重组质粒、及其应用
[0001]本专利技术总地涉及生物
，具体涉及重组新城疫病毒及制备方法、重组质粒、及其应用。
技术介绍
[0002]治疗癌症的手段主要有手术、放疗、化疗、免疫疗法、单克隆抗体疗法和病毒疫苗。
[0003]恶性肿瘤是危害人类健康的重大疾病之一。《2015全球癌症统计》数据显示，2015年全球新增约1410万例癌症病例，癌症死亡人 数达820万。预计到2025年，全球每年新增癌症病例数将高达2449万例。长期以来，人们治疗癌症的方法主要以传统的手术切除和 放化疗为主，这些手段可以在一定程度上控制肿瘤的发展，但是对于晚期肿瘤扩散患者的疗效有限，并且这些手段同时对人体的正常细胞 产生严重的创伤。因此，急需一种新的治疗恶性肿瘤的方法，溶瘤病毒疗法是一种通过病毒选择性感染肿瘤细胞来杀伤肿瘤的新型肿瘤治 疗方法。作为肿瘤免疫的重要组成部分，与其他肿瘤免疫疗法相比具有很大优势。溶瘤病毒疗法历经三个阶段的发展，已取得了很大的成 效。目前可以通过携带外源基因增加抗肿瘤效果，其中T-vec携带GM-CSF后，展现出良好疗效，于2015年获得美国FDA批准用于首次 复发不可切除的黑色素瘤局部治疗。同年12月T-vec又获得欧盟批准，表明溶瘤病毒的发展具有很大潜力。
[0004]20世纪50年代，人们发现NDV(Newcastle disease virus新城疫病毒)能抑制胃癌转移。因此NDV可作为一种新兴的肿瘤生物 治疗因子，其本身的高靶向性以及分子生物技术的成熟使其在肿瘤治疗中的应用研究越来越深入。NDV为单股负链RNA病毒，编码6种 结构蛋白(L、NP、P、HN、F、M)。
[0005]与其他溶瘤病毒相比，新城疫病毒具有天然靶向肿瘤细胞、广谱抗肿瘤特性，在抗肿瘤方面具有更大的优势，但如何提高其溶瘤效果 和保证其安全性，仍然是我们需要面临的巨大难题。
技术实现思路
[0006]本专利技术的目的在于提供重组新城疫病毒及制备方法、重组质粒、及其应用。
[0007]本专利技术提供了一种重组新城疫病毒，将新城疫病毒Losata的F蛋白替换为新城疫病毒强毒株的F蛋白而获得。
[0008]可选地，如上述的重组新城疫病毒，所述重组新城疫病毒的F蛋白的编码DNA如SEQ ID NO:1自5
’
末端7274-8935位所示。
[0009]可选地，如上述的重组新城疫病毒，将新城疫病毒Losata的基因组中的F基因替换为新城疫病毒强毒株的F基因而获得。优选地，所 述重组新城疫病毒的F基因的对应DNA如SEQ ID NO:1自5
’
末端7274-8935位所示。更优选地，所述重组新城疫病毒的基因组对应的 DNA如SEQ ID NO:1所示。
[0010]可选地，如上述的重组新城疫病毒，所述重组新城疫病毒的基因组对应的DNA还包
括外源基因，所述外源基因选自DR5、TRAIL、 hIL2、P53、PD1、CD和mIL12中的一种或多种。
[0011]优选地，所述外源基因为DR5、TRAIL、hIL2、P53、PD1、CD或mIL12。
[0012]优选地，所述外源基因为mIL12-hIL2、P53-hIL2、PD1-hIL2或DR5-TRAIL。
[0013]优选地，所述DR5如SEQ ID NO:2所示，所述TRAIL如SEQ ID NO:3所示，所述hIL2如SEQ ID NO:4所示，所述P53如SEQ ID NO:5 所示，所述PD1如SEQ ID NO:6所示，所述CD如SEQ ID NO:7所示，所述mIL12如SEQ ID NO:8所示。
[0014]优选地，所述外源基因位于所述重组新城疫病毒的P基因和M基因之间。
[0015]本专利技术还提供了一种重组质粒，将pBrLosata质粒中的F基因替换获得，所述重组质粒的F基因如SEQ ID NO:1自5
’
末端7274-8935 位所示。
[0016]可选地，如上述的重组质粒，所述重组质粒为如SEQ ID NO:1所示的DNA分子质粒。
[0017]可选地，如上述的重组质粒，所述重组质粒还包括外源基因，所述外源基因选自DR5、TRAIL、hIL2、P53、PD1、CD和mIL12中的 一种或多种。
[0018]优选地，所述外源基因为DR5、TRAIL、hIL2、P53、PD1、CD或mIL12。
[0019]优选地，所述外源基因为mIL12-hIL2、P53-hIL2、PD1-hIL2或DR5-TRAIL。
[0020]优选地，所述DR5如SEQ ID NO:2所示，所述TRAIL如SEQ ID NO:3所示，所述hIL2如SEQ ID NO:4所示，所述P53如SEQ ID NO:5 所示，所述PD1如SEQ ID NO:6所示，所述CD如SEQ ID NO:7所示，所述mIL12如SEQ ID NO:8所示。
[0021]优选地，所述外源基因位于所述重组新城疫病毒的基因组P基因和M基因之间。
[0022]本专利技术还提供了一种重组新城疫病毒的制备方法，将上述的重组质粒转染至细胞或细胞系并培养，获得重组新城疫病毒。
[0023]可选地，如上述的制备方法，将上述的重组质粒、辅助质粒共转染至细胞或细胞系并培养。所述细胞为哺乳动物细胞。辅助质粒例如 为pBL-N质粒、pBL-P质粒、pBL-L质粒。
[0024]本专利技术还提供了上述的重组新城疫病毒、上述的重组质粒在制备药物中的应用。所述药物的功能如下(a)和/或(b)和/或(c)：(a) 治疗肿瘤；(b)抑制肿瘤细胞增殖；(c)杀伤肿瘤细胞。
[0025]本专利技术还提供了一种药物，包括上述的重组新城疫病毒，和/或上述的重组质粒。所述药物的功能如下(a)和/或(b)和/或(c)：(a) 治疗肿瘤；(b)抑制肿瘤细胞增殖；(c)杀伤肿瘤细胞。
[0026]可选地，所述肿瘤选自肝癌、乳腺癌、非小细胞肺癌、黑色素瘤、神经母细胞瘤、肺癌、胰腺癌、甲状腺癌、肾癌、神经胶质瘤、肌 肉瘤、食道癌、子宫癌、乳腺癌和结肠癌中的一种或多种。
[0027]可选地，所述肿瘤细胞选自肝癌细胞、乳腺癌细胞、非小细胞肺癌细胞、黑色素瘤细胞、神经母细胞瘤细胞、肺癌细胞、胰腺癌细胞、 甲状腺癌细胞、肾癌细胞、神经胶质瘤细胞、肌肉瘤细胞、食道癌细胞、子宫癌细胞、乳腺癌细胞和结肠癌细胞中的一种或多种。
[0028]本申请首先筛选出促细胞融合效果较强的毒株，获取其结构蛋白基因，利用反向遗传操作技术以及分子克隆技术，替换Losata的结构 蛋白基因，且进一步地插入外源基因，成功构建和拯救出重组嵌合病毒。将重组嵌合病毒在鸡胚中连续传代10代，增殖稳定性实验结果 证明，重组新城疫病毒可以在鸡胚中持续稳定的增殖，并且系统地比较重组嵌合病毒杀伤肿瘤细胞的效果。
[0029]本申请的重组嵌合病毒能有效抑制肿瘤细胞，促进肿瘤细胞的凋本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种重组新城疫病毒，其特征在于，将新城疫病毒Losata的F蛋白替换为新城疫病毒强毒株的F蛋白而获得。2.如权利要求1所述的重组新城疫病毒，其特征在于，所述重组新城疫病毒的F蛋白的编码DNA如SEQ ID NO:1自5
’
末端7274-8935位所示。3.如权利要求1所述的重组新城疫病毒，其特征在于，将新城疫病毒Losata的基因组中的F基因替换为新城疫病毒强毒株的F基因而获得；优选地，所述重组新城疫病毒的F基因的对应DNA如SEQ ID NO:1自5
’
末端7274-8935位所示；更优选地，所述重组新城疫病毒的基因组对应的DNA如SEQ ID NO:1所示。4.如权利要求1所述的重组新城疫病毒，其特征在于，所述重组新城疫病毒的基因组对应的DNA还包括外源基因，所述外源基因选自DR5、TRAIL、hIL2、P53、PD1、CD和mIL12中的一种或多种；优选地，所述外源基因为DR5、TRAIL、hIL2、P53、PD1、CD或mIL12；优选地，所述外源基因为mIL12-hIL2、P53-hIL2、PD1-hIL2或DR5-TRAIL；优选地，所述DR5如SEQ ID NO:2所示，所述TRAIL如SEQ ID NO:3所示，所述hIL2如SEQ ID NO:4所示，所述P53如SEQ ID NO:5所示，所述PD1如SEQ ID NO:6所示，所述CD如SEQ ID NO:7所示，所述mIL12如SEQ ID NO:8所示；优选地，所述外源基因位于所述重组新城疫病毒的P基因和M基因之间。5.一种重组质粒，其特征在于，将pBrLosata质粒中的F基因替换获得，所述重组质粒的F基因如SEQ ID NO:1自5
’
末端7274-8935位所示。6.如权利要求5所述的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒为如SEQ ID NO:1所示的DNA分子质粒。7.如权利要求5所述的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒还包括外源基因，所述外源基因选自DR5、TRAIL...
【专利技术属性】
技术研发人员：肖伟，李德山，刘天艳，刘芝航，王振中，姜珊，
申请(专利权)人：江苏康缘瑞翱生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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