重组猪伪狂犬病毒及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种重组猪伪狂犬病毒及其制备方法和应用，所述重组猪伪狂犬病毒为基因组中插入了猪非典型性瘟病毒E2基因的表达盒的猪伪狂犬病毒变异株GDR。本发明专利技术提供了一种重组猪伪狂犬病毒，通过将猪非典型性瘟病毒(APPV)E2基因与猪伪狂犬病毒变异株结合在一起，获得了一种全新的重组猪伪狂犬病毒rPRV

【技术实现步骤摘要】
重组猪伪狂犬病毒及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及动物病毒学领域，特别是涉及一种重组猪伪狂犬病毒及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]瘟病毒是一类有囊膜高度变异的单股正链RNA病毒，属于黄病毒科瘟病毒属，可感染猪、反刍动物和野生动物等。猪非典型性瘟病毒(atypical porcine pestivirus，APPV)是2015年首次发现的新型瘟病毒(Hause,B.M.,et al,2015.Discovery of a novel putative atypical porcine pestivirus in pigs in the USA.The Journal of general virology 96,2994
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2998)，至今世界范围的十余个国家商业猪群中相继出现了多起APPV感染的病例，不同地区学者分离到的APPV毒株存在很大的变异性。APPV被相继报道与仔猪先天性震颤密切相关。仔猪先天性震颤(CT)，俗称“仔猪抖抖病”或“跳跳病”，是指刚出生仔猪头部、四肢等局部或全身肌肉表现阵发性挛缩的一种疾病，可导致仔猪站立困难、吮乳受阻甚至死亡。患病猪的各种组织均可检测出APPV，但病毒含量最高的为下颌淋巴结，中等病毒含量的为外周淋巴器官(脾脏、扁桃体和腹股淋巴结)、中枢神经系统(脑干、大脑和小脑等)和消化系统(十二指肠)。APPV发病仔猪剖检无明显大体病变，APPV引起的AII型CT仔猪组织病理特征为脑白质空泡化，进一步观察其超微结构为小脑和脊髓髓鞘形成减少和破坏及脑白质髓磷脂崩解。此外免疫组化显示患病猪脊髓少突胶质细胞减少，表明APPV可能对胎儿少突胶质细胞有毒害作用，影响髓磷脂的形成，导致其功能丧失。通过对妊娠母猪以肌注或子宫方式接种APPV，结果显示接种APPV母猪粉面的新生仔猪表现CT症状，且患病仔猪的各种组织样品均检测出APPV，证明了APPV可通过胎盘传播，胎儿发育期感染APPV会造成胎猪中枢神经损伤，从而导致新生仔猪表现CT症状。另外，在出生时表现过CT症状的成年公猪的精液和包皮液中检测出APPV，表明感染过APPV的公猪可短暂性地或持续性地通过精液排毒。研究发现在曾患病猪的唾液腺、十二指肠、结肠和胰腺器官也可检测出APPV，表明APPV可能通过粪口途径传播(Groof A D,Deijs M,Guelen L,et al.Atypical Porcine Pestivirus:A Possible Cause of Congenital Tremor Type A
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II in Newborn Piglets.Viruses,2016,8(10):271)。
[0003]APPV作为新发现瘟病毒，与猪瘟病毒(CSFV)之间存在着较远的遗传关系，APPV与CSFV的核苷酸同源性约为50％。APPV基因组两端为非编码区(untranslated region，UTR)即5
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UTR和3
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UTR(从N到C端)，中间是一个大的开放阅读框(opening reading frame,ORF)，ORF编码一个大的多聚蛋白然后切割成较小的蛋白。病毒所有蛋白的编码顺序为：Npro、C、Erns、E1、E2、P7、NS2、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B(Hause,B.M.,et al,2015.Discovery of a novel putative atypical porcine pestivirus in pigs in the USA.The Journal of general virology 96,2994
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2998)。APPV作为猪中新出现的瘟病毒之一，其相关研究仍处于初步阶段，目前对于猪非典型性瘟病毒尚无预防用生物制品。
[0004]伪狂犬病(Pseudorabies，PR)是一种由伪狂犬病毒(Pseudorabiesvirus，PRV)感
染引起的急性传染病，可引起仔猪的高死亡率、母猪的繁殖障碍、育肥猪的神经及呼吸系统症状、公猪的种用性能降低或丧失等，对养猪业危害极大。病猪的临床症状和病程随年龄不同而有很大差异。哺乳仔猪最为敏感，15日龄以内的仔猪常表现为最急性型，病程不超过72h，死亡率100％，主要表现为体温升高、拉稀、发抖、运动不协调、流涎、颈部肌肉僵硬、四肢划水样运动，最后昏迷死亡。育肥猪则大多数伴有体温升高，呼吸困难，一般不发生死亡，耐过后呈隐性感染带毒或排毒。成年猪常不呈现可见临床症状或仅表现为轻微体温升高，一般不发生死亡。母猪妊娠初期，可在感染后的20天左右发生流产，在妊娠后期，经常发生死胎和木乃伊胎，或者产出弱胎和死胎。PRV属疱诊病毒科疱疹病毒甲亚科，暂定水痘病毒属，病毒粒子呈椭圆或圆形，无囊膜粒子直径为110～150nm，有囊膜的成熟病毒粒子直径180nm。PRV是疱疹病毒中抵抗力较强的一种，在物体表面和液体中可存活7天，在pH4～9之间保持稳定。腐败条件下，病料中的病毒经11天失去感染力。PRV对乙醚、氯仿等脂溶剂、福尔马林和紫外线照射等敏感，5％石碳酸经2min灭活，0.5％～1％氢氧化钠使其灭活。PRV对热的抵抗力较强，55～60℃经30～50min才能灭活，80℃经3min灭活。PRV感染猪不表现临床症状，但感染性病毒却能在猪体内长期以潜伏状态存在，也分离不到病毒，但用聚合酶探针方法可查出病毒基因组DNA的存在，在外界不良环境刺激等造成的免疫力减弱时，潜伏状态的病毒可转化为具有感染性的病毒。研究表明，与以往的毒株相比，新的PRV流行毒株发生明显变异(Wu R,Bai C,Sun J,Chang S,Zhang X.Emergence of virulent pseudorabies virus infection in northern China.J Vet Sci.2013,14(3):363
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365)，且致病性明显增强，现有的疫苗不能完全保护新流行毒株的感染。
[0005]因此，猪非典型性瘟病毒和伪狂犬病毒研究给养猪业造成了很大的经济损失，研究如何预防猪非典型性瘟病毒和伪狂犬病毒的感染对养猪业具有重要意义。

技术实现思路

[0006]基于此，有必要提供一种免疫后既能产生针对伪狂犬病毒变异株抗体又能产生针对猪非典型性瘟病毒抗体的重组猪伪狂犬病毒。
[0007]一种重组猪伪狂犬病毒，所述重组猪伪狂犬病毒为缺失了基因组的第123210～124654位核苷酸，并在缺失的位置插入了猪非典型性瘟病毒E2基因的表达盒的猪伪狂犬病毒变异株GDR。
[0008]本专利技术提供了一种重组猪伪狂犬病毒，通过将猪非典型性瘟病毒(APPV)E2基因与猪伪狂犬病毒变异株结合在一起，获得了一种全新的重组猪伪狂犬病毒rPRV
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E2。将猪非典型性瘟病毒(APPV)E2基因的表达盒插入到猪伪狂犬病毒变异株基因组中，导致缺失了部分US7和US8基因，得到的重组猪伪狂犬病毒(rPRV
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组猪伪狂犬病毒，其特征在于，所述重组猪伪狂犬病毒为缺失了基因组的第123210～124654位核苷酸，并在缺失的位置插入了猪非典型性瘟病毒E2基因的表达盒的猪伪狂犬病毒变异株GDR。2.根据权利要求1所述的重组猪伪狂犬病毒，其特征在于，所述猪非典型性瘟病毒E2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。3.根据权利要求1所述的重组猪伪狂犬病毒，其特征在于，所述表达盒所用启动子为CMV启动子。4.根据权利要求1所述的重组猪伪狂犬病毒，其特征在于，所述表达盒所用终止子为SV40。5.权利要求1～4任一项所述的重组猪伪狂犬病毒在制备用于预防非典型性猪瘟和伪狂犬病的疫苗中的应用。6.一种用于预防非典型性猪瘟和伪狂犬病的疫苗，其特征在于，包括权利要求1～4任一项所述的重组猪伪狂犬病毒以及佐剂。7.一种权利要求1～4任一项所述的重组猪伪狂犬病毒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：构建含有所述猪非典型性瘟病毒E2基因的表达盒的转移载体，将所述转移载体与所述猪...

【专利技术属性】
技术研发人员：李群辉，林丽苗，周庆丰，曹雪珍，吴雨，李薇，蔡新斌，吴云燕，申翰钦，
申请(专利权)人：温氏食品集团股份有限公司，
类型：发明
国别省市：