一种表达埃博拉GP蛋白的重组病毒及其制备方法和应用技术

本发明专利技术属于生物工程技术领域。具体涉及一种表达埃博拉GP蛋白的重组病毒、该重组病毒的构建、制备方法及其在抗埃博拉病毒中的应用。所述的重组病毒为可以表达埃博拉GP蛋白的重组水泡型口炎病毒rVSVΔG

【技术实现步骤摘要】
一种表达埃博拉GP蛋白的重组病毒及其制备方法和应用


[0001]本专利技术属于生物工程
具体涉及一种表达埃博拉GP蛋白的重组病毒、该重组病毒的构建、制备方法及其在抗埃博拉病毒中的应用。

技术介绍

[0002]埃博拉病毒病(Ebola virus disease，EVD)是由埃博拉病毒(Ebola virus，EBOV)感染引起的急性，发热并伴有严重出血症状的烈性人兽共患病。EBOV是致死率最高的病原之一，感染后致死率最高可达90％。自1976年EHF在扎伊尔东北部和苏丹南部暴发以来，至今发生过多次疫情。至今已发现并分离多种抗原型的EBOV，分别为扎伊尔型(Zaire Ebola virus,ZEBOV)，苏丹型(Sudan ebola virus,SEBOV)，莱斯顿型(Reston ebola virus,REBOV)，本迪布焦型(Bundigbugyo ebola virus,BEBOV)和塔伊森林型(Forest ebola virus，TAFV)，而其中ZEBOV爆发次数最多、致死率最高。EVD病程短，感染1～4天就会死亡。
[0003]EBOV属于丝状病毒科(Filoviridae)，EBOV属，具有囊膜，基因组为不分节段的单股负链RNA病毒。EBOV的基因组编码7种结构蛋白，从3
’
端到5
’
端依次为核蛋白(NP)，VP35，VP40，糖蛋白(GP)，VP30，VP24以及RNA依赖的RNA聚合酶蛋白(L)，此外，EBOV还编码两种非结构蛋白：sGP和ssGP。EBOV的GP蛋白是病毒粒子表面唯一的跨膜蛋白，通过与宿主细胞表面的受体结合介导病毒与宿主细胞融合，使病毒吸附并进入细胞。成熟的GP蛋白以三聚体的形式呈现在病毒粒子表面，是诱导产生中和抗体的最关键蛋白，是保护动物免受病毒感染的最关键的免疫原性蛋白。
[0004]2014年在西非出现的疫情是继1976年首次发现EBOV以来发生的最严重且最复杂的EBOV疫情。此次疫情爆发流行的EBOV属于ZEBOV，但其为一个新变种，其GP蛋白与1976年的ZEBOV株相比，氨基酸同源性为97.6％。2014年西非流行株的抗原性与之前相比发生了一定的变化。研制能够快速激发免疫应答的疫苗对于紧急免疫、挽救病人生命，非常重要。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种表达埃博拉GP蛋白的重组病毒和该重组病毒的构建方法，方法简单，易行，易于大规模生产。本专利技术还提供了该重组病毒的应用。
[0006]为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为：
[0007]一种表达埃博拉GP蛋白的重组病毒，所述的重组病毒为可以表达埃博拉GP蛋白的重组水泡型口炎病毒rVSVΔG
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Makona
‑
GP；
[0008]该病毒含有Makona GP蛋白基因的重组全基因组克隆质粒pCI
‑
RzVSVΔG
‑
Makona
‑
GP。
[0009]进一步的，所述的Makona GP蛋白基因序列为合成基因序列，其以EBOV西非流行株Makona株(GeneBank:KP178538.1)的GP的基因序列按照哺乳动物密码子偏噬性对GP蛋白进行人工密码子优化并合成，并在在起始密码ATG前分别引入VSV基因起始、终止及Kozak序列；其3
’→5’
的顺序为：
[0010]TATGAAAAAAACTAACAGATATCACGACGCGTACAACC。
[0011]本专利技术还提供一种表达埃博拉GP蛋白的重组病毒的制备方法。
[0012]表达埃博拉GP蛋白的重组病毒的制备方法，其步骤如下：
[0013](1)根据合成的Makona GP蛋白基因序列，以VSV病毒基因组质粒pCI
‑
RzVSVΔG插入位点Nhe I序列为同源臂，设计用于构建表达Makona GP基因的重组基因组全长cDNA质粒的同源重组引物F1
‑
F和F1
‑
R；
[0014](2)用限制性内切酶Nhe I酶切、线性化VSV病毒基因组质粒pCI
‑
RzVSVΔG，胶回收纯化线性载体；
[0015](3)采用PCR方法，以合成的Makona GP蛋白基因为模板，用引物F1
‑
F和F1
‑
R扩增Makona GP基因，胶回收纯化Makona GP基因；
[0016](4)将Makona GP蛋白基因同源重组至载体pCI
‑
RzVSVΔG的Nhe I位点，构成含有Makona GP蛋白基因的重组全基因组克隆质粒pCI
‑
RzVSVΔG
‑
Makona
‑
GP；
[0017](5)将重组质粒pCI
‑
RzVSVΔG
‑
Makona
‑
GP及辅助质粒pCI
‑
N、pCI
‑
P和pCI
‑
L，采用脂质体转染的方法共转染宿主细胞；
[0018](6)培养步骤(5)所述的宿主细胞2～4代；
[0019](7)收获步骤(6)所述细胞释放的病毒，即为表达Makona GP蛋白基因重组水疱性口炎病毒rVSVΔG
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Makona
‑
GP。
[0020]进一步的，所述的引物F1
‑
F和F1
‑
R序列如下，
[0021][0022]进一步的，步骤所述的(5)中的宿主细胞为HEK293细胞。
[0023]进一步的，步骤所述的(6)中的培养宿主细胞方法为：
[0024]HEK293细胞共转染重组质粒pCI
‑
RzVSVΔG
‑
Makona
‑
GP及辅助质粒pCI
‑
N、pCI
‑
P和pCI
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L 48h后，更换培养基，5％CO2、37℃继续培养直至出现细胞圆缩病变，收获培养物上清；培养物上清10倍稀释后接种于单层Vero E6细胞，连续接种2～4代后，收获Vero E6细胞释放的病毒。
[0025]进一步的，所述的培养基为含10％胎牛血清的DMEM。
[0026]本专利技术还提供一种埃博拉病毒病疫苗。
[0027]一种埃博拉病毒病疫苗，其含有表达埃博拉GP蛋白的重组病毒和药学上可接受的载剂。
[0028]本专利技术还提供一种表达埃博拉GP蛋白的重组病毒的应用。
[0029]一种表达埃博拉GP蛋白的重组病毒的用途，重组病毒在埃博拉病毒抗血清制备中的应用；
[0030]重组病毒在制备抗埃博拉GP蛋白血清中的应用。
[0031]一种表达埃博拉GP蛋白的重组病毒的用途，用于制备药剂、试剂、检测板或试本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种表达埃博拉GP蛋白的重组病毒，其特征在于，所述的重组病毒为可以表达埃博拉GP蛋白的重组水泡型口炎病毒rVSVΔG
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Makona
‑
GP；该病毒含有Makona GP蛋白基因的重组全基因组克隆质粒pCI
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RzVSVΔG
‑
Makona
‑
GP。2.根据权利要求1所述的一种表达埃博拉GP蛋白的重组病毒，其特征在于：所述的Makona GP蛋白基因序列为合成基因序列，其以EBOV西非流行株Makona株(GeneBank:KP178538.1)的GP的基因序列按照哺乳动物密码子偏噬性对GP蛋白进行人工密码子优化并合成，并在在起始密码ATG前分别引入VSV基因起始、终止及Kozak序列；其3
’→5’
的顺序为：TATGAAAAAAACTAACAGATATCACGACGCGTACAACC。3.权利要求1所述的表达埃博拉GP蛋白的重组病毒的制备方法，其步骤如下：(1)根据合成的Makona GP蛋白基因序列，以VSV病毒基因组质粒pCI
‑
RzVSVΔG插入位点Nhe I序列为同源臂，设计用于构建表达Makona GP基因的重组基因组全长cDNA质粒的同源重组引物F1
‑
F和F1
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R；(2)用限制性内切酶Nhe I酶切、线性化VSV病毒基因组质粒pCI
‑
RzVSVΔG，胶回收纯化线性载体；(3)采用PCR方法，以合成的Makona GP蛋白基因为模板，用引物F1
‑
F和F1
‑
R扩增Makona GP基因，胶回收纯化Makona GP基因；(4)将Makona GP蛋白基因同源重组至载体pCI
‑
RzVSVΔG的Nhe I位点，构成含有Makona GP蛋白基因的重组全基因组克隆质粒pCI
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RzVSVΔG
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Makona
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GP；(5)将重组质粒pCI
‑
RzVSVΔG
...

【专利技术属性】
技术研发人员：步志高，王翀，温志远，葛金英，王喜军，
申请(专利权)人：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心，
类型：发明
国别省市：