一种表达非洲猪瘟病毒三基因缺失重组伪狂犬病毒毒株、构建方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种表达非洲猪瘟病毒三基因缺失重组伪狂犬病毒毒株、构建方法及其应用，属于生物医药技术领域，本发明专利技术利用CRISPR/Cas9技术快速编辑PRV病毒株基因组，将PRV三个非必需毒力基因TK、gI和gE基因删除，再利用同源重组修复，在TK和gI/gE基因的位置分别定点插入ASFV的CD2v和p72，或，p54和p30的蛋白表达盒。本发明专利技术无需利用和去除筛选标记，同时对三个基因进行编辑并插入两个外源基因，方法简洁、快速、高效，所构建的重组毒株，为预防PRV和ASFV的感染提供了一种疫苗候选毒株，所建立的方法为新型疫苗的研发提供了新的方法及思路。方法为新型疫苗的研发提供了新的方法及思路。

【技术实现步骤摘要】
一种表达非洲猪瘟病毒三基因缺失重组伪狂犬病毒毒株、构建方法及其应用


[0001]本专利技术涉及生物医药
，具体涉及一种表达非洲猪瘟病毒三基因缺失重组伪狂犬病毒毒株、构建方法及其应用。

技术介绍

[0002]非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swinefever virus，ASFV)感染导致的家猪和野猪的烈性传染病，可致感染猪100％ 发病和死亡。然而，目前世界上没有可用于非洲猪瘟防控的疫苗和药物，只 能通过严格的生物安全措施进行防控。这种防控措施成本高，效果有限，疫 苗是防控传染病最为经济和有效的手段。目前，世界上在研非洲猪瘟疫苗主 要有灭活疫苗、亚单位疫苗、DNA疫苗、弱毒活疫苗等。
[0003]灭活疫苗：早期疫苗研究主要集中在灭活疫苗。灭活疫苗安全、但细胞免疫应答弱，且很难诱导机体产生有效的中和抗体，对ASFV强毒攻击无有效的保护作用，并可能存在抗体介导的感染增强。
[0004]亚单位疫苗：CD2v、p72、p54和p30蛋白均可诱导中和抗体，可作为亚单位疫苗开发的候选抗原。研究人员利用杆状病毒载体表达相关蛋白来免疫猪群，对保护猪群免受强毒攻击有一定效果。但目前亚单位疫苗中所使用的 ASFV保护性抗原不足以提供完整保护。少数ASFV蛋白作为抗原，即使出现中和抗体，也很难提供有效的免疫保护。
[0005]DNA疫苗：目前报导的DNA疫苗可以在宿主中诱导高水平的特异性T 细胞反应，产生体液免疫和细胞免疫，但仍无法提供有效保护。通过DNA 疫苗实现提供有效免疫保护的目标仍有很长的路要走。
[0006]弱毒活疫苗：(1)自然弱毒株疫苗或常规技术致弱弱毒疫苗：从自然届 筛选天然弱毒株作为疫苗候选株或通过细胞连续传代得到的ASFV弱毒株能 诱导针对亲本毒株的保护性免疫反应。此类疫苗可能存在交叉保护，但自然 弱毒株易出现毒力返强，同时存在严重副作用；(2)基因工程致弱弱毒疫苗： 采用基因工程技术，人工进行基因缺失以获得减毒疫苗株。我国报道了一株 由哈尔滨兽医研究所构建的基因缺失病毒株(HLJ/18
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7GD)，初步试验证明 该七基因缺失疫苗具有较好的安全性和有效性。但是，所为弱毒是相对于机 体免疫力正常的动物而言，如果动物有免疫抑制病或其它基础病等所致的免 疫力低下，则弱毒疫苗对它们而言可能就是致病、甚至致死的强毒；另，不 同弱毒疫苗株存在重组而产生新的致病毒株的风险；再，所有弱毒苗均存在 返强的可能。
[0007]病毒活载体疫苗：大量研究表明，病毒载体疫苗可以诱导猪体内产生强烈的体液体液反应和细胞免疫，为抵抗ASFV感染提供部分有效保护。但是，病毒载体疫苗所诱导的免疫反应以及保护效力仍需进一步评估。
[0008]目前国内外针对非洲猪瘟疫苗研究主要是利用基因删除技术进行减毒活疫苗的研究，这种策略研制减毒活疫苗至少存在两大制约瓶颈：一是疫苗的安全性难以保证；二是没有可用于商业化生产减毒活疫苗的细胞系。用同为大型DNA病毒的猪伪狂犬病毒(PRV)
(已有成熟疫苗)做骨架，生产嵌合载体疫苗可以解决上述两个制约因素，同时，还能成为多联、多价疫苗，一种疫苗防两个甚至三个病。
[0009]ASFV是大型双股DNA病毒，基因组大小为170
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193kbp,含160
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175个开放阅读框，可以编码150
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200种蛋白质。目前已知病毒蛋白p72(B646L)、p54(E183L)和p30(CP204L)可作为中和抗体的靶点，CD2v(EP402R)的表达也可诱导部分保护作用。因此，可将上述基因插入PRV载体，创制新型重组PRV非洲猪瘟病毒疫苗。
[0010]伪狂犬病毒(PseudorabiesVirus，PRV)属于疱疹病毒科，α疱疹病毒亚科，水痘病毒属。该病毒可引起猪伪狂犬病(Porcinepseudorabies)，感染新生仔猪主要表现为神经症状,也可出现腹泻等消化系统症状；妊娠母猪感染后可引起流产,产死胎、木乃伊胎及呼吸系统症状。PRV基因组>143kbp，可容纳较长的外源基因，是比较理想的嵌合苗构建载体。因此，通过对病毒非必须基因的删除，降低病毒毒力。在此基础上插入外源靶向基因，构建出表达非洲猪瘟基因的重组伪狂犬病毒嵌合载体疫苗是一种理想的途径。
[0011]CRISPR/Cas9系统是最新的基因编辑工具，获得2020年度诺贝尔化学奖。CRISPR/Cas9系统基本工作原理是利用sgRNA引导Cas9蛋白结合靶基因位点，在特定基因位点产生DNA双链断裂，再通过提供同源序列进行同源重组修复可以在靶基因位点处插入特定序列，从而实现基因编辑的目的。CRISPR/Cas9作为一种高效基因编辑工具，CRISPR/Cas9系统已广泛应用于生物医药领域。
[0012]目前利用CRISPR/Cas9构建表达非洲猪瘟蛋白的PRV多基因缺失毒株，主要有以下报道：Feng等以gE/gI双基因缺失的伪狂犬病病毒株为骨架，在TK基因处通过单sgRNA切割后，将CD2v的表达盒插入。重组片段插入TK基因N端第108和109个碱基之间。其中N端同源臂492bp，C端同源臂466bp。EGFP由CMV启动子驱动，Flag
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CD2v
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Flag由EF1α启动子驱动，同时带有绿色荧光和Flag标签，但未去除筛选标记，参考说明书附图5。
[0013]黄剑同样在gE/gI双基因缺失的PRV毒株上基础上进行了重组病毒的构建，使用双sgRNA策略介导的同源重组，将含CMV启动子的ASFV的p72、p54、p30、CD2v、pEP153R表达盒分别插入到PRV基因组中，并替换了PRV的TK基因，筛选纯化得到重组病毒rPRV
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p72、rPRV
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p54、rPRV
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p30、rPRV
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CD2v和rPRV
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pEP153R，此方案未使用筛选标记。
[0014]德国学者的技术路线为：筛选出表达Cas9蛋白的细胞系，将Bartha株基因组缺失gG基因插入BAC载体构建感染性克隆质粒pPrV
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BaΔgG，进一步在此基础上缺失gD基因的启动子和起始序列，构建pPrV
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BaΔgGD，缺失gD基因的病毒生长受限制，可方便重组病毒的筛选，通过同源修复载体pUC
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BAKJCAGPLnew去除BAC质粒序列的同时，替换上ASFV蛋白的表达盒与gD基因缺失部分，可获得正常复制的重组病毒。过程十分繁琐(参考说明书附图6)，但利用了CAG启动子，增强了蛋白表达能力。因此，现有技术存在下列问题：
[0015](1)现有技术均未在PRV野毒变异株基础上进行基因编辑，而是先通过构建BAC质粒和双基因缺失毒株后，再进行重组病毒的构建，过程复杂。
[0016](2)现有技术部分带有筛选标记，且并本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种表达非洲猪瘟病毒三基因缺失重组伪狂犬病毒毒株，其特征在于：于2021年5月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，猪疱疹病毒1型PRV TK
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/gI
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/gE
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p54
+
/p30
+
，保藏编号为：CCTCC NO：V202139；猪疱疹病毒1型PRV TK
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/gI
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/gE
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‑
CD2v
+
/p72
+
，保藏编号为：CCTCC NO：V202128。2.一种表达非洲猪瘟病毒三基因缺失重组伪狂犬病毒毒株，其特征在于：在伪狂犬病毒TK，gI/gE基因处分别定点插入CD2v和p72，且TK，gI/gE基因全部缺失。3.一种表达非洲猪瘟病毒三基因缺失重组伪狂犬病毒毒株，其特征在于：在伪狂犬病毒TK，gI/gE基因处分别定点插入p54和p30，且TK，gI/gE基因全部缺失。4.一种表达非洲猪瘟病毒三基因缺失重组伪狂犬病毒毒株的构建方法，其特征在于：采用CRISPR/Cas9编辑PRV病毒株基因组，将PRV的TK、gI/gE基因删除，再利用同源重组修复，在TK和gI/gE基因的位置分别定点插入ASFV的CD2v和p72，或，p54和p30,且TK、gI/gE基因全部缺失。5.根据权利要求4所述的一种表达非洲猪瘟病毒三基因缺失重组伪狂犬病毒毒株的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：S1.获取变异株PRV基因组全长序列；S2.根据变异株PRV的TK、gI/gE基因测序序列设计引导Cas9蛋白特异性切割目的基因的sgRNA，分别为sgRNA
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TK,sgRNA
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gI/gE；在其上设计合成正反向sgRNA单链序列，并将其退火后得到的双链sgRNA连接至PX459质粒上，转化和提取表达sgRNA序列和Cas9蛋白的PX459
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TK、PX459
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gI/gE质粒载体；S3.体外分别扩增TK基因、gI/gE基因左右同源臂TKhmL、TKhmR、gI/gEhmL、gI/gEhmR，通过酶切连接，构建同源臂质粒pUC19
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TKhm、pUC19
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gI/gEhm；在各个左右同源臂之间插入CAG
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bGHpA元件，构建出中间质粒pUC19
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TKhm
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CAG
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bGHpA和pUC19
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gI/gEhm
‑
CAG
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bGHpA；S4.化学合成ASFV的CD2v、p30、p54、p72基因序列；S5.利用酶切连接或无缝克隆的方法，进一步构建同源修复供体质粒pUC19
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TKhm
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CAG
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CD2v
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bGHpA、pUC19
‑
TKhm
‑
CAG
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p54
‑...

【专利技术属性】
技术研发人员：唐玉新，叶昱，顾俊，宋德平，黄冬艳，
申请(专利权)人：江西农业大学，
类型：发明
国别省市：