携带红系基因编辑系统的慢病毒及药物技术方案

本发明专利技术涉及一种携带红系基因编辑系统的慢病毒，所述慢病毒携带有特异性靶向BCL11A增强子的CRISPR

【技术实现步骤摘要】
携带红系基因编辑系统的慢病毒及药物


[0001]本专利技术涉及基因工程领域，尤其是一种涉及携带红系基因编辑系统的慢病毒及药物。

技术介绍

[0002]地中海贫血症和镰刀状细胞贫血症，是由于珠蛋白单基因突变而引起血红蛋白生成障碍。地中海贫血症是全球分布最广、累及人群最多的一种单基因遗传病，也是我国影响最大、发病率最高的遗传病，仅在我国就约有3000万地中海贫血症基因携带者，地中海贫血症在我国北方少见，但在广东、广西、四川等地多见。镰刀状细胞贫血症在我国发病率极低，但在非洲发病率很高，因为携带镰刀状细胞贫血症基因突变的人不易感染疟疾，也不易感染艾滋病，而非洲正是疟疾和艾滋病发病率最高的地区，因此，镰刀状细胞贫血症患者在非洲反而有了生存优势，因此得已保留。
[0003]地中海贫血症种类较多，其中β
‑
地中海贫血是最常见、最严重的类型。β
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地中海贫血是世界上最常见的单基因常染色体隐性遗传性疾病之一，在地中海地区(5
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15％)、中东和西亚(2
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5％)、东南亚(高达10％)和南亚(高达18％)人群中高发。在我国，高发区主要分布在长江以南各省区，其中以两广地区最为严重。目前，全球正在接受治疗的β
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地中海贫血患者估计高达20万。β
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地中海贫血症主要是由于β珠蛋白基因及其调控序列基因缺陷导致β
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珠蛋白链合成减少或合成障碍，进而致使α/β
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珠蛋白比例失调所引起。相对过剩α<br/>‑
珠蛋白沉积在红细胞内形成包涵体，导致红细胞生成障碍。在临床上，β
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地中海贫血患者常常由于大量无效红细胞生成和红细胞膜破坏而导致严重的溶血性贫血。
[0004]输血治疗是目前临床缓解重度地中海贫血症状的常规方案，但是长期大量输血却会加重患者铁离子沉积，最终因铁超载导致器官衰竭而死亡。为了防止铁超载相关风险，患者必须坚持同时接受铁螯合治疗方案。然而，治疗依从性仍然是一个关键的挑战，即使采用当前的输血疗法，患者30岁之前的总生存率也只有55％左右。
[0005]目前，重度β
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地中海贫血的唯一治愈性治疗方案是异体骨髓移植。但是异体骨髓移植存在一些重大风险，如移植过程中的感染、移植失败和移植物抗宿主病(GvHD)，其中一些风险甚至是致命的。因此需要寻找人类白细胞抗原(HLA)相匹配的、年轻的(&lt;16岁)、无明显铁超载的同胞捐献者供体，以尽可能避免发生上述风险。但由于合适供者来源受限及费用昂贵，大部分患者难以得到及时的救治。因此，基于基因治疗的自体造血干细胞移植目前正成为“一站式”治愈β
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地中海贫血的新希望，其最大的优势在于不需要骨髓捐赠和异体移植，而且一次治疗可能产生永久性“治愈”效果，有望取代目前并不完美的治疗方案。
[0006]β
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地中海贫血是由于表达β
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珠蛋白的基因出现突变所致，之前的研究发现，γ
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珠蛋白与β
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珠蛋白功能相似，而γ
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珠蛋白在人类成年后就会沉默不再表达。因此，如果能够重新激活γ
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珠蛋白基因的表达，就能够弥补β
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珠蛋白的缺失，从而缓解或治愈β
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地中海贫血。BCL11A是一种转录因子，可抑制红系细胞中的γ
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珠蛋白和胎儿血红蛋白表达。因此，靶向抑制BCL11A在理论上可以重新激活γ
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珠蛋白表达，从而治疗β
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地中海贫血。
[0007]国外的研究团队从患者体内获得了CD34+造血干细胞和祖细胞，然后通过电穿孔导入特异性靶向BCL11A增强子的CRISPR
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Cas9基因编辑系统，然后回输经过CRISPR
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Cas9编辑BCL11A增强子的自体CD34+细胞。基于此，2018年，CRISPRTherapeutics和VertexPharmaceuticals的CTX001获得了美国和欧洲监管机构的新药研究申请批件，这也是全球首个由制药公司发起的体外CRISPR疗法的新药临床试验。国内2020年7月22日，上海邦耀生物科技有限公司宣布，邦耀生物与中南大学湘雅医院合作开展的“经γ
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珠蛋白重激活的自体造血干细胞移植治疗重型β
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地中海贫血安全性及有效性的临床研究”的临床试验取得初步成效。这是亚洲首次通过基因编辑技术治疗地中海贫血，也是全世界首次通过CRISPR基因编辑技术治疗β0/β0型重度地中海贫血症的成功案例。2021年1月18日，博雅辑因宣布中国国家药品监督管理局药品审评中心已经批准其针对输血依赖型β地中海贫血的CRISPR/Cas9基因编辑疗法产品ET
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01的临床试验申请，这也是国内首个获国家药监局批准开展临床试验的基因编辑疗法产品和造血干细胞产品。
[0008]但目前，国内外普遍采用电穿孔的方法将编辑BCL11A增强子的编辑系统导入到造血干细胞中，其操作复杂、效率低且安全性能差。

技术实现思路

[0009](一)要解决的技术问题
[0010]鉴于现有技术的问题，本专利技术提供一种携带红系基因编辑系统的慢病毒，提出利用慢病毒载体携带特异性靶向BCL11A增强子的CRISPR
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Cas9基因编辑系统，通过慢病毒感染造血干细胞的方法将BCL11A增强子的CRISPR
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Cas9基因编辑系统递送到造血干细胞内，具有操作简单、转化效率和安全性高的特点。
[0011]进一步地，该特异性靶向BCL11A增强子的CRISPR
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Cas9基因编辑系统采用β
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珠蛋白基因的启动子驱动Cas9基因表达，以提高基因编辑的红系特异性。
[0012](二)技术方案
[0013]为了达到上述目的，本专利技术采用的主要技术方案包括：
[0014]第一方面，本专利技术提供一种携带红系基因编辑系统的慢病毒，其包括慢病毒，所述慢病毒携带有特异性靶向BCL11A增强子的CRISPR
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Cas9基因编辑系统的序列。
[0015]优选地，所述特异性靶向BCL11A增强子的CRISPR
‑
Cas9基因编辑系统的序列中用于调控Cas9蛋白表达的启动子为红系特异的β
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globin的启动子pHBB(如SEE ID NO：1所示序列)。
[0016]优选地，所述慢病毒载体基因组序列的特征包括位于表达膜蛋白VSV.G的质粒(pMD2.G)，表达gag
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pol的包装辅助质粒(psPAX2)和表达红系特异编辑系统的质粒。
[0017]第二方面，本专利技术提供一种用于基因编辑的质粒，所述质粒为：将pLenti
‑
CRISPR
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种携带红系基因编辑系统的慢病毒，其特征在于，其包括慢病毒，所述慢病毒携带有特异性靶向BCL11A增强子的CRISPR
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Cas9基因编辑系统的序列。2.根据权利要求1所述的慢病毒，其特征在于，所述特异性靶向BCL11A增强子的CRISPR
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Cas9基因编辑系统的序列中用于调控Cas9蛋白表达的启动子为红系特异的β
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globin的启动子pHBB。3.根据权利要求2所述的慢病毒，其特征在于，所述慢病毒载体基因组序列包括位于表达膜蛋白VSV.G的质粒(pMD2.G)，表达gag
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pol的包装辅助质粒(psPAX2)和表达红系特异编辑系统的质粒。4.一种用于基因编辑的质粒，其特征在于，所述质粒为：将pLenti
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CRISPR
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V2(addgene,#78852)中的原始启动子EF
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1αcorepromoter替换为红系特异的β
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globin的启动子pHBB后，再将用于靶向BCL11A增强子的寡核苷酸序列H58
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Enhancer2克隆上去所得到。5.根据权利要求4所述的用于基因编辑的质粒，其特征在于，所述用于基因编辑的质粒的基因组序列包括：红系特异的β
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globin的启动子pHBB，表达核酸酶的CRISPR
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Cas9序列和表达特异性靶向BCL11A增强子的gRNA的寡核苷酸序列H58
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Enhancer2。6.一种用于基因编辑的质粒的构建方法，其特征在于，其包括：S1:用红系特异的β
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globin的启动子pHBB替换pLenti
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CRISPR
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V2(addgene,#78852)中的原始启动子EF
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1αcorepromoter获得pLenti
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pHBB
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CRISPR
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V2质粒载体；具体步骤为：S11:人工合成红系特异的β
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globin的启动子pHBB(如SEQ ID NO:1),合成完成后将序列放到通用载体pUC57(addgene,#49822)上，在载体引入酶切位点EcoRI和XbaI，得到载体pUC57
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pHBB；S12:将pLenti
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CRISPR
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V2质粒和pUC57
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pHBB分别用限制性内切酶EcoRI和XbaI进行双酶切，双酶切后进行琼脂糖电泳后切胶回收获得pLenti
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CRISPR
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V2载体片段和pHBB片段；S13:将pLenti
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CRISPR
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V2载体片段和pHBB片段采用连接酶连接；S14:将连接产物转化感受态Trans1T1，经混匀、冰浴、热休克后再立即冰浴，先用无抗生素的液体培养基培养后，再转入含有氨苄青霉素的琼脂平板上继续培养，之后挑取单克隆菌落接种于含有氨苄青霉素液体培养液中振荡培养，提取质粒并进行双酶切鉴定后进行测序鉴定，成功构建得pLenti
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pHBB
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CRISPR
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V2质粒载体；S2:将用于靶向BCL11A增强子的寡核苷酸序列H58
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Enhancer2克隆到pLenti
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pHBB
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CRISPR
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V2质粒载体中获得用于基因编辑的质粒pLenti
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【专利技术属性】
技术研发人员：董文吉，张莹莹，董祖伊，张艳君，刘子瑾，程谟斌，赵忠亮，
申请(专利权)人：中吉智药南京生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：