一种携带Klotho启动基因重组腺病毒的细胞构建方法及其应用技术

本发明专利技术公开了重组腺病毒技术领域的一种携带Klotho启动基因的重组腺病毒，通过将Klotho启动基因插入含有腺病毒基因组的腺病毒穿梭质粒pHBAd

【技术实现步骤摘要】
一种携带Klotho启动基因重组腺病毒的细胞构建方法及其应用


[0001]本专利技术涉及重组腺病毒
，具体为一种携带Klotho启动基因重组腺病毒的细胞构建方法及其应用。

技术介绍

[0002]klotho基因是主要在肾脏和脑表达的基因,其表达产物有膜结合型和分泌型两种蛋白异构体形式,二者可能分别是膜结合受体和体液调节信号蛋白。klotho基因敲除后小鼠过早出现和人类衰老相关的多种行为和病理生理改变,如寿命缩短、运动失调、性功能障碍、痴呆、白内障、动脉粥样硬化、肺气肿、骨质疏松、免疫功能降低等。持续血液循环应激和慢性肾衰时肾klotho基因的表达下调。klotho基因是抑制衰老的基因,其分泌性蛋白是抗衰老激素。分泌型klotho蛋白有望成为防治老年病的有效药物。klotho基因敲除鼠是目前研究人类衰老及多种老年病发生、预防和治疗的最合适的动物模型；
[0003]肾脏是人体的重要器官，它的基本功能是生成尿液，借以清除体内代谢产物及某些废物、毒物，同时经重吸收功能保留水分及其他有用物质，如葡萄糖、蛋白质、氨基酸、钠离子、钾离子、碳酸氢本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种携带Klotho启动基因的重组腺病毒，其特征在于：通过将Klotho启动基因插入含有腺病毒基因组的腺病毒穿梭质粒pHBAd
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MCMV
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GFP中获得；构建所述重组腺病毒所用的穿梭质粒为pAdTrack
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CMV；构建所述重组腺病毒所用的病毒骨架质粒为pAdeasy
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1；构建所述重组腺病毒所用的包装细胞为人胚肾293A细胞。2.一种根据权利要求1所述的一种携带Klotho启动基因重组腺病毒的细胞构建方法，其特征在于：包括以下步骤：S1、目的基因Klotho启动基因的获取：提取Klotho启动基因的总mRNA，逆转录合成cDNA模板，使用Primer5.0软件设计针对Klotho启动基因全长的特异性引物，在上游引物加入BamHI酶切位点及Kozak序列，在下游引物加入HindIII酶切位点，上游引物和下游引物分别符合SEQID2&SEQID3的核苷酸序列；SEQID2AGAGGATCCACCACCATGGCCACCAATAAGGAG，SEQID3ATCAAGCTTTCAGGGGCCCTGGTCAGGTTGG；S1.1、用2
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PfuPCRMasterMix进行体外Touch
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DownPCR扩增获得目的基因RARγ，符合SEQID1的核苷酸序列；S2、Klotho启动基因片段的获得与重组穿梭质粒的构建；S2.1、采用无缝克隆技术将Klotho启动基因插入穿梭质粒载体载体pAdtrace
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TOX中，得到克隆载体pUC57
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PLCγ2；S2.2、以克隆载体pUC57
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PLCγ2为模板，以ForwardprimerRewardprimer为引物，PCR扩增，凝胶回收扩增产物PLCγ2，并利用SmaI将扩增产物PLCγ2酶切，凝胶回收得到PLCγ2酶切产物；S2.3、以SmaI酶切腺病毒穿梭质粒pHBAd
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MCMV
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GFP，对酶切后的产物进行凝胶回收和纯化，得到MCMV酶切产物；S2.4、利用DNAT4连接酶将PLCγ2酶切产物和MCMV酶切产物连接，得到重组穿梭质粒pHBAd
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MCMV
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GFP
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PLCγ2。3.根据权利要求2所述的一种携带Klotho启动...

【专利技术属性】
技术研发人员：贾政，邢正江，赵斌，孟凡棣，蒲磊，耿玥，邓嫒嫒，刘菲菲，
申请(专利权)人：昆明市延安医院，
类型：发明
国别省市：