猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒嵌合重组的PRRSVDIVA疫苗株cDY56制造技术

本发明专利技术属于兽用生物制品技术领域，涉及一种猪繁殖与呼吸障碍综合征嵌合重组的PRRSV DIVA疫苗株cDY56的构建方法和应用。利用基因Ⅱ型经典毒株DY株作为亲本株，用高致病性PRRSV XZ株的ORF5和ORF6基因替换亲本株相应基因，构建嵌合重组PRRSV疫苗株cDY56。本发明专利技术的嵌合重组PRRSV毒株cDY56相对于目前商品化的疫苗，在诱导体液免疫和细胞免疫以及降低免疫抑制等方面具有更好的效果，具有广阔的应用前景。前景。前景。

【技术实现步骤摘要】
猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒嵌合重组的PRRSV DIVA疫苗株cDY56


[0001]本专利技术属于兽用生物制品
，涉及一种猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒嵌合重组的PRRSV DIVA疫苗株cDY56的构建方法和应用。

技术介绍

[0002]猪繁殖与呼吸障碍综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS)于1987年在美国首次发现，目前该病已在全世界范围内流行,对养猪业造成了重大的经济损失。世界范围内，疫苗被广泛使用来保护或者减少PRRSV带来的损失。然而，无论减毒疫苗还是灭活疫苗以及各种亚单位疫苗都被证明效果不佳，只能提供部分保护。近些年来，人们尝试各种佐剂，试图改善PRRSV疫苗免疫保护效果差的问题。造成PRRSV疫苗免疫保护效果不好的原因很多，其中由于该病毒介导的特殊的免疫逃避机制以及抗原性基因的异质性占有很大一部分因素，因此，新型PRRS疫苗设计中，必须要考虑增加PRRSV不同亚型或毒株的交叉保护率的问题。
[0003]目前认为，PRRSV的GP2a、GP3、GP本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒嵌合重组的PRRSV DIVA疫苗株cDY56,其特征在于, 利用基因Ⅱ型经典毒株DY株作为亲本株，用高致病性PRRSV XZ株的ORF5和ORF6基因替换亲本株相应基因，构建嵌合重组PRRSV疫苗株cDY56。2.根据权利要求1所述猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒嵌合重组的PRRSV DIVA疫苗株cDY56,其特征在于,所述嵌合重组PRRSV疫苗株的全基因序列如SEQ ID NO:1所示。3.根据权利要求1所述猪繁殖与呼吸障碍综合征嵌病毒合重组的PRRSV DIVA疫苗株cDY56,其特征在于,所述嵌合重组PRRSV疫苗株,命名为PRRSV cDY56,保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为:CGMCC No.20711。4.权利要求1所述猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒嵌合重组的PRRSV DIVA疫苗株cDY56的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）斧头状核酶基因序列的PCR扩增及重组质粒pSK
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1R的构建以PRRSV DY株cDNA为模板，以R
‑
1S /R
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1R为引物，PCR扩增片段R1, R1纯化后作为模板，以R
‑
2S /R
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1R为引物，PCR扩增片段R2, R2纯化后作为模板，以R
‑
3S /R
‑
1R为引物，PCR扩增片段R3；将R3回收纯化的产物和质粒pSK
‑
1分别用XhoI、EcoRI双酶切，然后用T4连接酶将二者连接起来,1h后转到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，筛选阳性菌并提取质粒，得到质粒pSK
‑
1R；（2）PRRSV DY株Nsp2基因抗原肽FQQVKRLSS的敲除及SgrAI酶切位点的填加以PRRSV DY株cDNA为模板，以引物N
‑
1 S、 N
‑
1R和N
‑
2 S、 N
‑
2R进行PCR扩增片段N1和N2,以N
‑
1S/N
‑
2R为引物，对两片段进行重叠延伸扩增，获得融合目的片段N12，片段N12纯化回收后和重组质粒pSK
‑
1R进行MluI、ApaI双酶切后用T4连接酶进行连接，转化DH
5α
感受态细胞中，筛选阳性菌并提取质粒；（3）PRRSV DY株3
’
末端HDV核酶基因序列和BGH基因序列的填加以PRRSV DY株cDNA为模板，引物H
‑
1 S/ H
‑
1r进行PCR扩增片段H1；H 1纯化后作为模板，以H
‑
1S/ H
‑
2R为引物，PCR扩增片段H2， H2纯化后作为模板，以H
‑
1S/ H
‑
3R为引物PCR扩增片段H3；以质粒pCDNA3.1(+)为模板，以B
‑
1S /B
‑
1R为引物，PCR扩增片段BGH；以H3和BGH为模板，以HDV
‑
S为引物，对两片段进行重叠延伸扩增，获得融合目的片段HB；将重组质粒pSK
‑
4用NotI单酶切，将片段HB和重组质粒pSK
‑
4进行连接，1h后转到大肠杆菌DH
5α
感受态细胞中，筛选阳性菌并提取质粒；重组质粒命名为pSK
‑
4HB；（4）PRRSV DY株全长cDNA克隆的构建以PRRSV DY株cDNA为模板，用P2S/P2R和P3S/P3R为引物扩增，扩增片段P
‑
2和P
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3；以重组质粒pSK
‑
1R和重组质粒pSK
‑
1N为模板，P1S/P1R和P4S/P4R为引物，PCR扩增片段P
‑
1和P
‑
4；将纯化回收的4段PCR产物片段逐一连接，最终获得含有PRRSV DY 株全长基因组cDNA的质粒pCI
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DY；（5）含有PRRSV XZ株ORF5和ORF6的重组质粒pCI
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XZ56的构建以PRRSV XZ株cDNA为模板，XZ
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5S为引物，PCR扩增获得片段XZ56；以重组质粒pSK
‑
1N为模板，以D...

【专利技术属性】
技术研发人员：张松林，刘鸿艳，李峰，刘磊，马永彪，公鑫婧，沈志强，
申请(专利权)人：山东省滨州畜牧兽医研究院，
类型：发明
国别省市：