一种基于诱导型昆虫细胞生产AAV基因药物的方法技术

本发明专利技术涉及一种基于诱导型昆虫细胞生产AAV基因药物的方法，所述方法包括：(1)分别构建用于包装腺相关病毒的Rep基因质粒、Cap基因质粒和目的基因质粒；其中Rep基因质粒和Cap基因质粒含有晚期启动子；(2)将构建的三个质粒整合到Sf9昆虫细胞基因组上，得到可生产AAV的稳转细胞株；(3)大量扩增、培养所述稳转细胞株；在需要生产AAV时，用不携带外源基因的杆状病毒，感染所述稳转细胞株，以诱导稳转细胞株中的晚期启动子激活并驱动Rep基因和Cap基因表达，包装生产AAV。该方法不需要使用携带外源基因的杆状病毒，因此不会带来因杆状病毒大量复制扩增所带来的外源基因丢失的问题，有利于获得稳定的AAV产物，进一步简化AAV生产步骤，提高生产效率，实现AAV的大规模化高效生产并降低成本。

【技术实现步骤摘要】
一种基于诱导型昆虫细胞生产AAV基因药物的方法
本专利技术涉及生物
，尤其是一种基于诱导型昆虫细胞生产AAV基因药物的方法。
技术介绍
基因治疗的基本原理是运用重组DNA的技术，将具有正常基因及其表达所需的序列导入到病变细胞或体细胞，对DNA分子进行纠正或修复，从而达到治疗目的。相比于其他药物，基因治疗的优势在于从根本上解决问题。根据市场调研机构FortuneBusinessInsights发布的报告，2019年基因治疗市场规模为36.1亿美元，预计到2027年将达到356.7亿美元，预测期内的年均复合增长率(CAGR)为33.6％。目前，基因药物的病毒类载体主要是腺相关病毒(AAV)和慢病毒两大类，这两类载体根据各自的特点，分别用于不同的基因疗法和适应症。全球已有多款获批的遗传性疾病AAV载体基因疗法。Uniqure，诺华，SparkTherapeutics等重要机构在市场获得了先机。除此之外，也有一些重要制药企业的候选疗法处于临床阶段。2012年，欧盟委员会(EC)批准了西方世界首个基因治疗药物Glybera，该药来自荷兰生物技术公司UniQure，用于治疗一种极其罕见的遗传性疾病--脂蛋白脂肪酶缺乏症(LPLD)，其高达100万美元的定价创造了昂贵现代医药的新纪录。Glybera也是目前已经上市的唯一利用杆状病毒昆虫细胞生产的AAV载体的基因治疗药物。此外，Luxturna是由Spark(罗氏子公司)研发的一款基因疗法，于2017年12月获得美国FDA批准上市，Luxturna使用AAV2携带RPE65基因，采用在视网膜下腔直接注射的方法将病毒导入眼球中，用于治疗Leber先天性黑蒙2型(LCA2)的患者。未来几年将有十多款基因治疗的新药上市，基因治疗创新药物的发展离不开病毒载体生产技术的进步。目前基因药物高昂的价格与病毒载体的生产成本较高有密切关系，尤其是腺相关病毒载体。国际上除UniQure、Biomarin等少数企业利用杆状病毒昆虫系统解决临床级AAV载体生产问题外，大多数药企和CDMO平台仍然用传统的293T细胞质粒转染的方式生产，无法实现规模化生产以有效降低AAV的生产成本。利用杆状病毒昆虫细胞生产AAV是解决临床级病毒大规模生产的重要手段。目前，利用杆状病毒昆虫系统生产AAV问题的基本原理，如图1所示：将腺相关病毒的包装组分Rep,Cap和目的基因序列，分别克隆到三个杆状病毒载体上，利用三个杆状病毒感染昆虫sf9细胞，包装得到AAV。为了进一步简化流程，提高操作的稳定性，一种改进方法原理如图2所示：将腺相关病毒的包装组分Rep,Cap整合到昆虫sf9细胞的基因组上，构建成诱导型细胞系，然后将目的基因的序列克隆到杆状病毒载体上，利用杆状病毒载体感染昆虫sf9细胞并诱导Rep,Cap表达，包装生产AAV。这两种方法均在如下技术问题：(1)该两种方法，都利用携带外源基因的杆状病毒感染昆虫sf9细胞，然而携带了外源基因的杆状病其传代不稳定，外源基因会丢失，造成生产过程不稳定。杆状病毒是复制型病毒，作为生产AAV的原料，要大量复制扩增，扩增3-4代，外源基因就会丢失。生产时需要反复检测。一旦丢失，要重新扩增。(2)Rep,Cap蛋白有细胞毒性，如果持续表达，将不利于昆虫sf9细胞的大量扩增和培养，难以实现AAV的规模化生产和降低成本。此外，现有技术方法仍存在生产步骤不够简化及生产效率低等问题。
技术实现思路
(一)要解决的技术问题鉴于现有技术的上述缺点、不足，本专利技术提供一种基于诱导型昆虫细胞生产AAV基因药物的方法，该方法不需要使用携带外源基因的杆状病毒，解决携带外源基因的杆状病毒在大量复制扩增过程中容易丢失外源基因的问题，有利于获得稳定的AAV产物，并进一步简化AAV生产步骤，提高生产效率，实现AAV的大规模化高效生产并降低生产成本。(二)技术方案为了达到上述目的，本专利技术采用的主要技术方案包括：第一方面，本专利技术提供一种基于诱导型昆虫细胞生产AAV基因药物的方法，所述方法包括：(1)分别构建用于包装腺相关病毒的Rep基因质粒、Cap基因质粒和目的基因质粒；其中Rep基因质粒和Cap基因质粒含有晚期启动子；(2)将构建的三个质粒整合到Sf9昆虫细胞基因组上，得到可生产AAV的稳转细胞株；(3)大量扩增、培养所述稳转细胞株；在需要生产AAV时，用不携带外源基因的杆状病毒，感染所述稳转细胞株，以诱导稳转细胞株中的晚期启动子激活并驱动Rep基因和Cap基因表达，包装生产AAV。根据本专利技术的较佳实施例，步骤(1)中，Rep基因质粒、Cap基因质粒、目的基因质粒中分别含有早期启动子和筛选标签。所述早期启动子驱动筛选标签表达，以确保最终筛选得到同时包含Rep基因质粒、Cap基因质粒、目的基因质粒三个质粒的稳转细胞株。根据本专利技术的较佳实施例，步骤(2)中，分别将所述三个质粒逐一通过转染进入Sf9昆虫细胞中，每转染完一种质粒后，利用与该质粒中筛选标签相应的抗生素进行筛选，选出存活的细胞，用于下一种质粒的转染，最终得到可生产AAV的Sf9稳转细胞株。根据本专利技术的较佳实施例，步骤(1)中，Rep基因质粒为pBSK-HR5-IE-G2P-IEter-HR5-p10-Repintron-sv40，其包含pBSK商业化载体序列、HR5增强子、IE早期启动子、G2P(GFP-2A-puro，GFP和puromycin双标记)筛选标签、IEter转录终止序列、p10晚期启动子、及表达Rep蛋白的Repintron表达盒基因序列。根据本专利技术的较佳实施例，步骤(1)中，Cap基因质粒为pBSK-HR5-IE-BSD-IEter-HR5-pH-Capintron-sv40，其包含pBSK商业化载体序列、HR5增强子、IE早期启动子、BSD筛选标签、IEter转录终止序列、pH晚期启动子、及表达Cap蛋白的Capintron表达盒基因序列。根据本专利技术的较佳实施例，步骤(1)中，目的基因质粒为pBSK-HR5-IE-Neo-IEter-AAV-TargetGene，其包含pBSK商业化载体序列、HR5增强子、IE早期启动子、Neo筛选标签、IEter转录终止序列、及表达TargetGene的腺相关病毒基因组序列。根据本专利技术的较佳实施例，步骤(1)中，所述目的基因TargetGene为密码子优化的SMN1基因或编码可溶性胞外区ACE2蛋白的基因序列；其中，密码子优化的SMN1基因序列如SEQIDNo:12所示，所述编码可溶性胞外区ACE2蛋白的基因序列如SEQIDNo:13或SEQIDNo:14所示。筛选时，质粒中早期启动子IE可驱动Puro筛选标签、BSD筛选标签、Neo筛选标签表达(这些筛选标签实为抗生素抗性基因)，使细胞获得抗性，而能够在具有相应抗生素的培养基中存活下来，从而筛选出成功在Sf9昆虫细胞的基因组中同时转入了Rep基因质粒、Cap基因质粒和目的基因质粒三种质粒的稳转细胞株。可理解本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于诱导型昆虫细胞生产AAV基因药物的方法，其特征在于，所述方法包括：/n(1)分别构建用于包装腺相关病毒的Rep基因质粒、Cap基因质粒和目的基因质粒；其中Rep基因质粒和Cap基因质粒含有晚期启动子；/n(2)将构建的三个质粒整合到Sf9昆虫细胞基因组上，得到可生产AAV的稳转细胞株；/n(3)大量扩增、培养所述稳转细胞株；在需要生产AAV时，用不携带外源基因的杆状病毒，感染所述稳转细胞株，以诱导稳转细胞株中的晚期启动子激活并驱动Rep基因和Cap基因表达，包装生产AAV。/n

【技术特征摘要】
1.一种基于诱导型昆虫细胞生产AAV基因药物的方法，其特征在于，所述方法包括：
(1)分别构建用于包装腺相关病毒的Rep基因质粒、Cap基因质粒和目的基因质粒；其中Rep基因质粒和Cap基因质粒含有晚期启动子；
(2)将构建的三个质粒整合到Sf9昆虫细胞基因组上，得到可生产AAV的稳转细胞株；
(3)大量扩增、培养所述稳转细胞株；在需要生产AAV时，用不携带外源基因的杆状病毒，感染所述稳转细胞株，以诱导稳转细胞株中的晚期启动子激活并驱动Rep基因和Cap基因表达，包装生产AAV。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，Rep基因质粒、Cap基因质粒、目的基因质粒中分别含有早期启动子和筛选标签。


3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，分别将所述三个质粒逐一通过转染进入Sf9昆虫细胞中，每转染完一种质粒后，利用与该质粒中筛选标签相应的抗生素进行筛选，选出存活的细胞，用于下一种质粒的转染，最终得到包含Rep基因质粒、Cap基因质粒及目的基因质粒三个质粒的稳转细胞株，用于生产AAV。


4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，Rep基因质粒为pBSK-HR5-IE-G2P-IEter-HR5-p10-Repintron-sv40，其包含pBSK商业化载体序列、HR5增强子、IE早期启动子、G2P筛选标签、IEter转录终止序列、p10晚期启动子、及表达Rep蛋白的Repintron表达盒基因序列。


5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，Cap基因质粒为pBSK-HR5-IE-BSD-IEter-HR5-pH-Capintron-sv40，其包含pBSK商业化载体序列、HR5增强子、IE早期启动子、BSD筛选标签、IEter转录终止序列、pH晚期启动子、及表达Cap蛋白的Capintron表达盒基因序列。


6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，目的基因质粒为pBSK-HR5-IE-Neo-IEter-AAV-TargetGene，其包含pBSK商业化载体序列、HR5增强子、IE早期启动子、Neo筛选标签、IEter转录终止序列、及表达TargetGene的腺相关病毒基因组序列。<...

【专利技术属性】
技术研发人员：董文吉，刘子瑾，赵忠亮，曹帆，程谟斌，张艳君，
申请(专利权)人：中吉智药南京生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32