【技术实现步骤摘要】
一种基于诱导型昆虫细胞生产AAV基因药物的方法
本专利技术涉及生物
，尤其是一种基于诱导型昆虫细胞生产AAV基因药物的方法。
技术介绍
基因治疗的基本原理是运用重组DNA的技术，将具有正常基因及其表达所需的序列导入到病变细胞或体细胞，对DNA分子进行纠正或修复，从而达到治疗目的。相比于其他药物，基因治疗的优势在于从根本上解决问题。根据市场调研机构FortuneBusinessInsights发布的报告，2019年基因治疗市场规模为36.1亿美元，预计到2027年将达到356.7亿美元，预测期内的年均复合增长率(CAGR)为33.6％。目前，基因药物的病毒类载体主要是腺相关病毒(AAV)和慢病毒两大类，这两类载体根据各自的特点，分别用于不同的基因疗法和适应症。全球已有多款获批的遗传性疾病AAV载体基因疗法。Uniqure，诺华，SparkTherapeutics等重要机构在市场获得了先机。除此之外，也有一些重要制药企业的候选疗法处于临床阶段。2012年，欧盟委员会(EC)批准了西方世界首个基因治疗药物Glyber...
【技术保护点】
1.一种基于诱导型昆虫细胞生产AAV基因药物的方法，其特征在于，所述方法包括：/n(1)分别构建用于包装腺相关病毒的Rep基因质粒、Cap基因质粒和目的基因质粒；其中Rep基因质粒和Cap基因质粒含有晚期启动子；/n(2)将构建的三个质粒整合到Sf9昆虫细胞基因组上，得到可生产AAV的稳转细胞株；/n(3)大量扩增、培养所述稳转细胞株；在需要生产AAV时，用不携带外源基因的杆状病毒，感染所述稳转细胞株，以诱导稳转细胞株中的晚期启动子激活并驱动Rep基因和Cap基因表达，包装生产AAV。/n
【技术特征摘要】
1.一种基于诱导型昆虫细胞生产AAV基因药物的方法，其特征在于，所述方法包括：
(1)分别构建用于包装腺相关病毒的Rep基因质粒、Cap基因质粒和目的基因质粒；其中Rep基因质粒和Cap基因质粒含有晚期启动子；
(2)将构建的三个质粒整合到Sf9昆虫细胞基因组上，得到可生产AAV的稳转细胞株；
(3)大量扩增、培养所述稳转细胞株；在需要生产AAV时，用不携带外源基因的杆状病毒，感染所述稳转细胞株，以诱导稳转细胞株中的晚期启动子激活并驱动Rep基因和Cap基因表达，包装生产AAV。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，Rep基因质粒、Cap基因质粒、目的基因质粒中分别含有早期启动子和筛选标签。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，分别将所述三个质粒逐一通过转染进入Sf9昆虫细胞中，每转染完一种质粒后，利用与该质粒中筛选标签相应的抗生素进行筛选，选出存活的细胞，用于下一种质粒的转染，最终得到包含Rep基因质粒、Cap基因质粒及目的基因质粒三个质粒的稳转细胞株，用于生产AAV。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，Rep基因质粒为pBSK-HR5-IE-G2P-IEter-HR5-p10-Repintron-sv40，其包含pBSK商业化载体序列、HR5增强子、IE早期启动子、G2P筛选标签、IEter转录终止序列、p10晚期启动子、及表达Rep蛋白的Repintron表达盒基因序列。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，Cap基因质粒为pBSK-HR5-IE-BSD-IEter-HR5-pH-Capintron-sv40，其包含pBSK商业化载体序列、HR5增强子、IE早期启动子、BSD筛选标签、IEter转录终止序列、pH晚期启动子、及表达Cap蛋白的Capintron表达盒基因序列。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，目的基因质粒为pBSK-HR5-IE-Neo-IEter-AAV-TargetGene，其包含pBSK商业化载体序列、HR5增强子、IE早期启动子、Neo筛选标签、IEter转录终止序列、及表达TargetGene的腺相关病毒基因组序列。<...
【专利技术属性】
技术研发人员：董文吉，刘子瑾，赵忠亮，曹帆，程谟斌，张艳君，
申请(专利权)人：中吉智药南京生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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