HBV PreS1多肽修饰的人肝细胞特异靶向性的rAAV2载体及其制备方法和用途技术

本发明专利技术公开了HBV PreS1多肽修饰的人肝细胞特异靶向性的rAAV2载体及其制备方法和用途。本发明专利技术运用同源重组法，将preS1多肽基因插入rAAV 2的衣壳质粒，构建得到改造质粒；然后通过三质粒共转染HEK293细胞对改造质粒进行包装，再对病毒载体进行纯化以及检测后，得到具有肝靶向性的改造病毒载体，在肝脏的基因编辑与基因治疗研究领域具有很好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
HBVPreS1多肽修饰的人肝细胞特异靶向性的rAAV2载体及其制备方法和用途
本专利技术属于生物医学范畴中病毒载体
，具体涉及重组腺相关病毒载体及其临床应用前景。
技术介绍
我国是肝脏疾病的高发地区，肝癌更是危害我国国民健康的主要恶性肿瘤之一，迄今没有理想的根治药物。而随着生物医学科技的飞速发展，基因编辑与基因疗法有望成为人类战胜各类疾病的新技术之一。重组腺相关病毒(rAAV)作为常用的递送外源目的基因的载体之一，具有稳定性高、致病性低、免疫原性低、宿主范围广，能够介导外源基因长期表达等优点，因此被视为最有发展前景的基因治疗载体之一。但由于AAV的主要细胞受体硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPG)的广泛分布于各种细胞的细胞膜上，所以天然血清型的AAV不具有特定组织和器官的靶向性。因此，研究人员尝试通过多种手段以期赋予AAV新的靶向性。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有基因编辑与基因治疗技术的不足之处，提供了HBVPreS1多肽修饰的人肝细胞特异靶向性的rAAV2载体及其制备方法和用途。本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案之一是：一种HBVPreS1多肽修饰的rAAV2载体，其特征在于：在所述HBVPreS1多肽修饰的rAAV2载体的氨基酸序列中含有PreS1多肽序列，所述PreS1多肽序列选自：氨基酸序列如SEQIDNo.3所示的PreS1-1、氨基酸序列如SEQIDNo.4所示的PreS1-2、氨基酸序列如SEQIDNo.5所示的PreS1-3、氨基酸序列如SEQIDNo.6所示的PreS1-4、或氨基酸序列如SEQIDNo.8所示的PreS1-6。本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案之二是：一种编码HBVPreS1多肽修饰的rAAV2载体的核酸分子，所述核酸分子的序列为：在pAAV-H22质粒的587号位点插入有编码PreS1多肽的基因序列；所述PreS1多肽选自：氨基酸序列如SEQIDNo.3所示的PreS1-1、氨基酸序列如SEQIDNo.4所示的PreS1-2、氨基酸序列如SEQIDNo.5所示的PreS1-3、氨基酸序列如SEQIDNo.6所示的PreS1-4、或氨基酸序列如SEQIDNo.8所示的PreS1-6。在一个具体的实施例中：编码所述PreS1-1的基因序列的相应的引物对包括如SEQIDNo.9所示的上游引物和如SEQIDNo.10所示的下游引物，编码所述PreS1-2的基因序列的相应的引物对包括如SEQIDNo.11所示的上游引物和如SEQIDNo.12所示的下游引物，编码所述PreS1-3的基因序列的相应的引物对包括如SEQIDNo.13所示的上游引物和如SEQIDNo.14所示的下游引物，编码所述PreS1-4的基因序列的相应的引物对包括如SEQIDNo.15所示的上游引物和如SEQIDNo.16所示的下游引物，编码所述PreS1-6的基因序列的相应的引物对包括如SEQIDNo.19所示的上游引物和如SEQIDNo.20所示的下游引物。上述的HBVPreS1多肽修饰的rAAV2载体例如可通过上述的核酸分子编码得到。本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案之三是：一种HBVPreS1多肽修饰的rAAV2载体的制备方法，包括：1)病毒包装质粒的改造：通过同源重组法，将所述PreS1多肽序列对应的基因序列插入到pAAV-H22质粒的587号位点处，获得改造质粒，该改造质粒将作为后续改造病毒载体包装所需的实验材料；2)改造病毒载体的包装与检测：将改造质粒转入宿主细胞并进行病毒的包装，包装完成后使用碘克沙醇密度梯度离心和超滤离心对病毒载体进行纯化，纯化后的病毒载体进行衣壳蛋白检测(westernblot)和滴度检测(qPCR)，得到改造成功且滴度足够的改造病毒载体，即为所述的HBVPreS1多肽修饰的rAAV2载体。进一步地，所述步骤1)包括：将pAAV-H22质粒与pUCm-T质粒双酶切后，回收2749bp和2705bp的片段，进行酶连，构成工作质粒，该工作质粒含有pAAV-H22质粒上的587号改造位点；随后对所述工作质粒的587号位点进行线性化，再将所述PreS1多肽序列对应的基因序列插入到587号位点处，再对插入了基因序列的587号位点片段进行酶切，重新连回pAAV-H22质粒上，获得改造质粒。进一步地，所述线性化采用的引物对包括如SEQIDNo.1所示的上游引物和如SEQIDNo.2所示的下游引物。进一步地，所述步骤2)中，通过三质粒共转染法将改造质粒转入宿主细胞；采用的质粒包括pFd6、pAAV-eGFP和改造质粒。进一步地，所述宿主细胞为HEK293。本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案之四是：一种上述的HBVPreS1多肽修饰的rAAV2载体在制备治疗肝脏疾病的药物中的用途。一种上述的核酸分子在制备治疗肝脏疾病的药物中的用途。具体的，所述肝脏疾病例如包括肝癌。本专利技术所涉及的设备、试剂、工艺、参数等，除有特别说明外，均为常规设备、试剂、工艺、参数等，不再作实施例。本专利技术所列举的所有范围包括该范围内的所有点值。本专利技术所述“大约”、“约”或“左右”等指的是所述范围或数值的±20％范围内。本专利技术中，除有特别说明或在领域内有通用含义外，％均为质量百分比。本专利技术经研究发现，HBV只能特异性侵染灵长类动物的肝脏，preS1基因、preS2基因和S基因共同编码HBV衣壳表面的L蛋白，而PreS1多肽在HBV感染人肝细胞中发挥着重要作用。本专利技术运用同源重组法，将不同片段长度的6条preS1多肽基因分别插入rAAV2的衣壳质粒的587号位点处，由此构建出6种改造成功的衣壳质粒。然后通过三质粒共转染HEK293细胞对改造的病毒载体进行包装，再对病毒载体进行纯化以及检测后，于体外对人肝细胞系和非肝细胞系进行感染，通过荧光图片对比结果及统计结果，最终得到5种具有肝靶向性的改造病毒载体。本技术方案与
技术介绍
相比，它具有如下优点：本专利技术得到的HBVPreS1多肽修饰的人肝细胞特异靶向性的rAAV2载体，其肝细胞靶向性明显高于天然血清型的病毒载体，且对肝细胞的转染效率明显增强，在肝癌的基因编辑与基因治疗研究领域具有潜在的用途。附图说明图1为实施例1中各单个质粒载体酶切鉴定图(A：pAAV-H22和pUCm-T酶切验证；B：连接正确的工作载体的酶切验证)。图2用于说明实施例1中得到的587号位点处的线性化载体。图3用于说明实施例1中得到的含有587号位点处同源臂的各单个改造基因。图4为实施例1中得到的改造基因的测序比对结果。图5为实施例1中得到改造成功的质粒的酶切验证图。图6为实施例2中用于包装病毒的各质粒的酶切验证图(A：pAAV-eGFP；B：pFd6)。图7为实施例2中质粒转染48h后荧光表达情况(左白光，右荧光)，图中标尺为271μm。图本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种HBV PreS1多肽修饰的rAAV2载体，其特征在于：在所述HBV PreS1多肽修饰的rAAV2载体的氨基酸序列中含有PreS1多肽序列，所述PreS1多肽序列选自：氨基酸序列如SEQ ID No.3所示的PreS1-1、氨基酸序列如SEQ ID No.4所示的PreS1-2、氨基酸序列如SEQID No.5所示的PreS1-3、氨基酸序列如SEQ ID No.6所示的PreS1-4、或氨基酸序列如SEQID No.8所示的PreS1-6。/n

【技术特征摘要】
1.一种HBVPreS1多肽修饰的rAAV2载体，其特征在于：在所述HBVPreS1多肽修饰的rAAV2载体的氨基酸序列中含有PreS1多肽序列，所述PreS1多肽序列选自：氨基酸序列如SEQIDNo.3所示的PreS1-1、氨基酸序列如SEQIDNo.4所示的PreS1-2、氨基酸序列如SEQIDNo.5所示的PreS1-3、氨基酸序列如SEQIDNo.6所示的PreS1-4、或氨基酸序列如SEQIDNo.8所示的PreS1-6。


2.一种编码HBVPreS1多肽修饰的rAAV2载体的核酸分子，其特征在于：所述核酸分子的序列为：在pAAV-H22质粒的587号位点插入有编码PreS1多肽的基因序列；所述PreS1多肽选自：氨基酸序列如SEQIDNo.3所示的PreS1-1、氨基酸序列如SEQIDNo.4所示的PreS1-2、氨基酸序列如SEQIDNo.5所示的PreS1-3、氨基酸序列如SEQIDNo.6所示的PreS1-4、或氨基酸序列如SEQIDNo.8所示的PreS1-6。


3.根据权利要求2所述的核酸分子，其特征在于：编码所述PreS1-1的基因序列的相应的引物对包括如SEQIDNo.9所示的上游引物和如SEQIDNo.10所示的下游引物，编码所述PreS1-2的基因序列的相应的引物对包括如SEQIDNo.11所示的上游引物和如SEQIDNo.12所示的下游引物，编码所述PreS1-3的基因序列的相应的引物对包括如SEQIDNo.13所示的上游引物和如SEQIDNo.14所示的下游引物，编码所述PreS1-4的基因序列的相应的引物对包括如SEQIDNo.15所示的上游引物和如SEQIDNo.16所示的下游引物，编码所述PreS1-6的基因序列的相应的引物对包括如SEQIDNo.19所示的上游引物...

【专利技术属性】
技术研发人员：许瑞安，刘艳君，崔秀灵，
申请(专利权)人：华侨大学，
类型：发明
国别省市：福建;35