【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于基因递送以在细胞内持续存在的载体相关申请的交叉引用根据35U.S.C.§119(e)，本申请要求2018年6月22日提交的美国临时申请No.62/688,982、2018年6月25日提交的美国临时申请No.62/689,453、2018年7月13日提交的美国临时申请No.62/697,750以及2018年8月10日提交的美国临时申请No.62/717,310的权益，以引用的方式将它们的内容各自整体并入本文。
本专利技术涉及用于核酸序列的无细胞生产、核酸序列向哺乳动物细胞中的引入和表达(例如用于基因疗法)的载体和方法的领域。
技术介绍
期望以提供外源DNA编码的蛋白质的长期表达的方式引入外源DNA。已经开发了基于病毒的方案，其中使用病毒载体将外源DNA引入细胞，随后可使所引入的DNA整合到靶细胞的基因组中或保持游离。发现使用的基于病毒的载体包括逆转录病毒载体，例如基于莫洛尼鼠白血病病毒(Moloneymurineleukemiaviral)的载体、衍生自腺病毒的载体、衍生自腺相关病毒(AAV)的载体、衍生自HSV的载体、衍生自辛德毕斯(sindbis)的载体等。大量的兴趣集中在使用AAV载体上。最常见的血清型有12种。用于生产AAV载体的典型方法是使用表达AAVrep基因(需要rep来启动AAV的复制)和cap基因(需要cap来生产AAV)的细胞(例如昆虫细胞(如SF-9)或哺乳动物细胞)以用于形成病毒粒子，并将带有AAV反向末端重复(ITR)的质粒引入到这些细胞中，该AAV反向末端重复的侧翼具有含...
【技术保护点】
1.一种用于将核酸构建体引入靶细胞中以进行持续表达的方法，所述方法包括向所述靶细胞给予共价封闭的非病毒DNA构建体，所述共价封闭的非病毒DNA构建体包含：/na.至少一个DD-ITR，所述DD-ITR包含：/ni.反向末端重复，所述反向末端重复具有A、A’、B、B’、C、C’和D区域，/nii.D’区域，/niii.其中，所述D和D’区域是互补回文序列，并且其中，所述D和D’的位置与所述A和A’区域邻近；/nb.核酸构建体的互补链，包含能够退火成可表达的dsDNA的预定的DNA序列；/nc.其中，所述DNA构建体形成具有共价封闭的发夹末端的线性DNA；以及/nd.其中，所述DNA构建体能够在所述靶细胞中表达所述预定的DNA序列。/n
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180622 US 62/688,982;20180625 US 62/689,453;20181.一种用于将核酸构建体引入靶细胞中以进行持续表达的方法，所述方法包括向所述靶细胞给予共价封闭的非病毒DNA构建体，所述共价封闭的非病毒DNA构建体包含：
a.至少一个DD-ITR，所述DD-ITR包含：
i.反向末端重复，所述反向末端重复具有A、A’、B、B’、C、C’和D区域，
ii.D’区域，
iii.其中，所述D和D’区域是互补回文序列，并且其中，所述D和D’的位置与所述A和A’区域邻近；
b.核酸构建体的互补链，包含能够退火成可表达的dsDNA的预定的DNA序列；
c.其中，所述DNA构建体形成具有共价封闭的发夹末端的线性DNA；以及
d.其中，所述DNA构建体能够在所述靶细胞中表达所述预定的DNA序列。
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述D区域包含切口产生位点。
3.如权利要求1所述的方法，其中，所述D区域的长度为至少5个核苷酸。
4.如权利要求1所述的方法，其中，所述D区域的长度为约20nt。
5.如权利要求1所述的方法，其中，所述D区域对应于细小病毒ITR的细小病毒D区域。
6.如权利要求1所述的方法，其中，所述细小病毒是依赖病毒。
7.如权利要求1所述的方法，其中，所述依赖病毒是AAV。
8.如权利要求1的方法，其中，所述预定的DNA序列与启动子可操作地连接。
9.如权利要求8所述的方法，其中，所述ITR充当启动子。
10.如权利要求8所述的方法，其中，所述启动子与所述ITR是分开的。
11.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中，所述DD-ITR驱动所述预定的DNA序列的表达。
12.如权利要求4所述的方法，其中，所述D和D’区域具有置换、插入和/或缺失，并保留所述区域的至少5个核酸。
13.如权利要求12所述的方法，其中，所保留的核酸包含所述A和A’区域以及所述D和D’区域的切口产生位点和/或接合点。
14.如权利要求1所述的方法，其中，所述预定的DNA序列编码蛋白质、蛋白质片段、肽或功能性RNA。
15.如权利要求14所述的方法，其中，所述功能性RNA选自于由微小RNA、RNAi、shRNA和用于CrisperCas9重组的向导RNA所组成的组。
16.如权利要求1-15中任一项所述的方法，其中，在所述D和D’区域与所述预定的DNA序列之间存在至少2个核苷酸作为间隔区。
17.如权利要求14所述的方法，其中，在所述D和D’区域与所述启动子之间存在至少2个核苷酸作为间隔区。
18.如权利要求16或17所述的方法，其中，所述间隔区为至少5个核苷酸。
19.如权利要求16或17所述的方法，其中，所述间隔区为至少20个核苷酸。
20.如权利要求16或17所述的方法，其中，所述间隔区为至少25个核苷酸。
21.如权利要求1-20中任一项所述的方法，其中，所述至少一个DD-ITR由AAVITR、细小病毒ITR或合成的ITR产生。
22.如权利要求1-21中任一项所述的方法，其中，所述DNA构建体包含两个DD-ITR。
23.如权利要求1-22中任一项所述的方法，其中，所述D区域来自与所述ITR不同的构造型。
24.如权利要求22所述的方法，其中，DD-ITR各自衍生自不同的病毒血清型。
25.如权利要求22所述的方法，其中，一个DD-ITR衍生自AAV2ITR，第二个DD-ITR衍生自AAV5ITR。
26.如权利要求1-25中任一项所述的方法，其中，在所述B和B’区域或C和C’区域中存在缺失、置换和/或插入。
27.如权利要求1-26中任一项所述的方法，其中，在所述A和A’区域中存在缺失、置换和/或插入。
28.如权利要求1-27中任一项所述的方法，其中，所述DNA构建体进一步在共价封闭末端处包含部分原核端粒酶结合位点，所述共价封闭末端在宿主细胞中由原核端粒酶活性形成。
29.如权利要求28所述的方法，其中，在诱导型启动子的控制下，所述宿主细胞表达所述原核端粒酶。
30.如权利要求1-27中任一项所述的方法，其中，所述DNA构建体进一步在共价封闭末端处包含部分原核端粒酶结合位点，所述共价封闭末端由体外原核端粒酶活性形成。
31.如权利要求1-30中任一项所述的方法，其中，所述DNA构建体在所述靶细胞内持续存在，并引起所述预定序列的持续表达。
32.如权利要求1-31中任一项所述的方法，其中，所述DNA构建体能够在所述细胞中转化成多联体结构。
33.如权利要求1-32中任一项所述的方法，其中，所述预定的DNA序列在所述靶细胞中持续表达至少2周-5周、至少1个月-12个月、至少1年-10年的时间段。
34.如权利要求32-33中任一项所述的方法，其中，所述多联体结构在所述靶细胞中持续存在，并引起所述预定序列的持续表达。
35.如权利要求32-34中任一项所述的方法，其中，所述多联体结构在所述靶细胞染色体外持续存在。
36.如权利要求32-34中任一项所述的方法，其中，所述多联体结构整合到所述靶细胞染色体中。
37.如权利要求1-36中任一项所述的方法，其中，核酸是治疗性核酸。
38.如权利要求1-37中任一项所述的方法，其中，所述靶细胞在体外。
39.如权利要求1-37中任一项所述的方法，其中，所述靶细胞在体内。
40.如权利要求1-37中任一项所述的方法，其中，将所述构建体离体给予所述靶细胞。
41.如权利要求1-40中任一项所述的方法，其中，所述靶细胞是遗传缺陷型细胞和/或患病细胞。
42.如权利要求1-41中任一项所述的方法，其中，所述靶细胞是患病细胞。
43.如权利要求1-42中任一项所述的方法，其中，所述靶细胞选自于由如下所组成的组：神经细胞、肺细胞、视网膜细胞、上皮细胞、平滑肌细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞、胰细胞、肝细胞、肾细胞、心室肌细胞、骨细胞、脾细胞、角质形成细胞、成纤维细胞、内皮细胞、前列腺细胞、生殖细胞、祖细胞、干细胞、癌细胞和肿瘤细胞。
44.一种用于将预定的核酸序列递送至靶细胞中以进行持续表达的DNA载体，所述DNA载体包含：
c.两个DD-ITR，所述DD-ITR各自包含：
i.具有A、A’、B、B’、C、C’和D区域的反向末端重复；
ii.D’区域；以及
iii.其中，所述D和D’区域是长度约为5nt-20nt的互补回文序列，且位置与所述A和A’区域邻近；
d.所述预定的核酸序列(例如用于表达的异源基因)；以及
其中，在共价封闭的非病毒DNA的情况下，所述两个DD-ITR位于所述核酸的侧翼。
45.如权利要求44所述的DNA载体，其中，所述预定的核酸序列与启动子可操作地连接。
46.如权利要求44所述的DNA载体，其中，所述DD-ITR驱动所述预定的核酸序列的表达。
47.如权利要求46所述的DNA载体，其中，所述D和D’区域具有置换、插入和/或缺失，并保留所述区域的至少5个核酸。
48.如权利要求47所述的DNA载体，其中，所保留的核酸包含所述A和A’区域以及所述D和D’区域的切口产生位点和/或接合点。
49.如权利要求44所述的DNA载体，其中，所述预定的核酸序列编码蛋白质、蛋白质片段、肽或功能性RNA。
50.如权利要求49所述的DNA载体，其中，所述功能性RNA选自于由微小RNA、RNAi、shRNA和用于CrisperCas9重组的向导RNA所组成的组。
51.如权利要求45所述的DNA载体，其中，在所述D和D’区域与所述预定的核酸序列之间存在至少2个核苷酸作为间隔区。
52.如权利要求46所述的DNA载体，其中，在所述D和D’区域与所述启动子之间存在至少2个核苷酸作为间隔区。
53.如权利要求51或52所述的DNA载体，其中，所述间隔区为至少5个核苷酸。
54.如权利要求53所述的DNA载体，其中，所述间隔区为至少20个核苷酸。
55.如权利要求53所述的DNA载体，其中，所述间隔区为至少25个核苷酸。
56.如权利要求44-55中任一项所述的DNA载体，其中，所述DD-ITR由ITR产生，所述ITR选自于由细小病毒ITR和合成的ITR所组成的组。
57.如权利要求56所述的DNA载体，其中，所述细小病毒是依赖病毒。
58.如权利要求57所述的DNA载体，其中，所述依赖病毒是AAV。
59.如权利要求44-58中任一项所述的DNA载体，其中，所述DNA构建体包含多于两个的DD-ITR。
60.如权利要求59所述的DNA载体，其中，各DD-ITR衍生自不同的病毒血清型。
61.如权利要求60所述的DNA载体，其中，一个DD-ITR衍生自AAV2ITR，第二个DD-ITR衍生自AAV5ITR。
62.如权利要求44-61中任一项所述的DNA载体，其中，在所述B和B’区域或C和C’区域中存在缺失、置换或插入。
63.如权利要求44-61中任一项所述的DNA载体，其中，在所述A和A’区域中存在缺失、置换或插入。
64.如权利要求44-63中任一项所述的DNA载体，其中，所述DNA载体进一步包含部分原核端粒酶结合位点，并且其中，所述共价封闭末端由体外原核端粒酶活性形成。
65.如权利要求44-64中任一项所述的DNA载体，其中，所述DNA载体在所述靶细胞内持续存在，并引起所述预定序列的持续表达。
66.如权利要求44-65中任一项所述的DNA载体，其中，所述DNA载体能够在所述细胞中转化成多联体结构。
67.如权利要求44-66中任一项所述的DNA载体，其中，所述预定的DNA序列在所述靶细胞中持续表达至少2周-5周、至少1个月-12个月、至少1年-10年的时间段。
68.如权利要求66-67中任一项所述的DNA载体，其中，所述多联体结构在所述靶细胞中持续存在，并引起所述预定序列的持续表达。
69.如权利要求66-68中任一项所述的DNA载体，其中，所述多联体结构在所述靶细胞染色体外持续存在。
70.如权利要求66-68中任一项所述的DNA载体，其中，所述多联体结构整合到所述靶细胞染色体中。
71.如权利要求44-70中任一项所述的DNA载体，其中，所述预定的核酸是治疗性核酸。
72.如权利要求44-71中任一项所述的DNA载体，其中，至少一个DD-ITR是AAVITR。
73.如权利要求44-72中任一项所述的DNA载体，其中，所述DNA载体进一步包含位于两个DD-ITR的侧翼的部分原核端粒酶结合位点。
74.如权利要求73所述的DNA载体，其中，所述位于两个DD-ITR的侧翼的部分原核端粒酶结合位点由体外原核端粒酶活性或由体内原核端粒酶活性形成。
75.如权利要求44-74中任一项所述的DNA载体，其中，所述共价封闭的非病毒DNA构建体在所述靶细胞内作为多联体结构持续存在。
76.如权利要求75所述的DNA载体，其中，所述DNA载体促进所述核酸持续表达2周-5周、1个月-12个月、1年-10年或更长的时间段。
77.一种用于将核酸引入靶细胞以进行持续表达的方法，所述方法包括向所述靶细胞给予共价封闭的非病毒DNA构建体，所述共价封闭的非病毒DNA构建体包含：
a.至少一个ITR序列，所述ITR序列选自于由图5所示的ITR所组成的组；
b.核酸构建体的互补链，其中，所述核酸构建体包含预定的DNA序列，其中，所述互补链能够退火成可表达的dsDNA；并且
c.其中，所述DNA构建体形成具有发夹共价封闭末端的线性DNA。
78.如权利要求77所述的方法，其中，所述ITR序列在任一侧以互补序列D和D’作为侧翼，从而产生DD-ITR。
...
【专利技术属性】
技术研发人员：理查德·裘德·萨穆尔斯基，
申请(专利权)人：阿斯克肋匹奥生物制药公司，
类型：发明
国别省市：美国;US
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