佛司可林诱导型启动子和低氧诱导型启动子制造技术

本发明专利技术涉及佛司可林诱导的和低氧诱导的顺式调控元件、启动子和载体及其使用方法。顺式调控元件、启动子和载体及其使用方法。顺式调控元件、启动子和载体及其使用方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】佛司可林诱导型启动子和低氧诱导型启动子


[0001]本专利技术涉及佛司可林(Forskolin)诱导型顺式调控元件、启动子和载体以及它们的使用方法。本专利技术还涉及低氧诱导型启动子和载体，特别是生物处理载体，以及它们的使用方法。

技术介绍

[0002]下面的讨论是为了帮助读者理解本公开，并不构成对现有技术的内容或相关性的任何承认。
[0003]治疗性蛋白质/多肽或核酸在制药业中的应用越来越多。治疗性蛋白质往往由经基因修饰的生物体在严格调控的过程中大量生产。进行基因修饰是为了使细胞能够表达重组的表达产物。其他形式的生物蛋白(例如酶、抗体和其他有用的蛋白质)也是在类似的过程中生产的。
[0004]基因修饰通常包括修饰细胞以包括表达盒，通常以载体的形式，该表达盒包含与启动子可操作地连接的编码表达产物的编码序列。启动子可以是组成型的，也可以是诱导型的。
[0005]诱导型启动子允许在需要的时候诱导表达产物的产生，这在很多方面是有用的。诱导型启动子可用于生产对细胞有毒或会抑制细胞生长的表达产物，因为它允许在诱导表达产物的产生和收获之前使细胞生长到特定的密度或数量。诱导型启动子还可用于表达辅因子，其提高表达产物的产量、效力或稳定性。由于它们的有用性，人们对诱导型启动子(优选具有最小的泄漏性)有需求。
[0006]本领域已知的诱导型启动子包括糖诱导型启动子，如鼠李糖启动子(WO2006/061174A2)，和碳源耗尽诱导型启动子，如pG1(WO2013/050551A1)。这些启动子需要包含一种物质(如鼠李糖)或撤走一种在这之前一直存在于培养物中的物质(如碳源)。
[0007]这些方法有潜在的缺点。大规模培养可能需要大量该添加或撤走的物质，这可能是昂贵的。此外，该物质的存在在最终的医药产品中可能是不想要的，例如，如果它对人类消费不安全，因此可能需要确保该物质被完全去除。这些方法可能也很耗时，因为它们需要在大型培养物中均匀混合新的物质，或者将已经存在于培养物中的物质耗尽到一定的阈值以下。然后，这种物质必须在细胞中被吸收，以便它能影响基因的表达，或者从细胞中耗尽，以便解除对基因表达的抑制。希望提供诱导型启动子，其可克服这些缺点中的一些或全部。
[0008]同样，在基因治疗中，希望提供能够驱动基因表达的调控核酸序列，以便在体内产生蛋白质或核酸表达产物。还希望提供可诱导的基因表达系统，这样就可以根据需要诱导基因表达。可诱导性是指在需要时可以诱导治疗性基因表达产物的表达。此外，如果诱导是剂量依赖性的，那么治疗性基因表达产物的表达水平可以通过调整施用的诱导剂的量来调节。希望提供具有这些特征中的部分或全部的诱导型启动子。
[0009]因此，需要可诱导的调控序列来控制许多情况下的基因表达，尤其是在基因治疗中的治疗性基因表达和/或生物处理中的治疗性表达产物的生产。
[0010]诱导型启动子可以通过使用cAMPRE和/或AP1 TFBS，由腺苷酸环化酶的激活剂进行诱导。ATP衍生物环状腺苷单磷酸酯(也称为cAMP、环状AMP或3
‘
,5
‘‑
环状腺苷单磷酸酯)是许多生物过程中重要的第二信使。它的主要功能是在许多不同的生物体中进行细胞内信号转导。cAMP依赖性途径已被充分研究，它在(Yan等人，2016)中被回顾。
[0011]环状AMP是通过激活腺苷酸环化酶(adenylyl cyclase)(通常也被称为adenyl cyclase和adenylate cyclase，缩写为AC)产生的。腺苷酸环化酶的激活驱动一个级联，经由蛋白激酶A，导致转录因子CREB的激活，该CREB结合特定的TFBS，称为cAMPRE，其序列为TGACGTCA(SEQ ID NO:1)，以调控基因表达。
[0012]激活腺苷酸环化酶的另一个间接影响是随后激活转录因子AP1。AP1是由变异的Fos和Jun蛋白组成的二聚体，其中有许多形式。这些蛋白具有涉及许多蛋白激酶的复杂调控途径，但cAMP水平的升高被认为能稳定蛋白c
‑
Fos并上调其转录，导致AP1的激活。例如，参见(Hess等人，2004)和(Sharma&Richards，2000)。AP1与特定的TFBS结合以调节基因表达，该TFBS称为AP1位点并具有共有序列TGA[GC]TCA(SEQ ID NO:2)，。
[0013]本专利技术提出了可通过使用cAMPRE和/或AP1 TFBS而由腺苷酸环化酶的激活剂诱导的新型合成CRE。
[0014]诱导型启动子可被低氧诱导。细胞对低氧条件的反应在所有真核生物中是保守的。对低氧压力的反应是由一般称为低氧诱导因子(HIF)的转录因子介导的，该低氧诱导因子包括HIF1和HIF2。这些因子对细胞内的氧气浓度降低很敏感。氧气敏感性是通过HIF1的两个亚基之一HIF1α在常氧下的降解和在低氧期间的稳定而实现的。在低氧下，HIF1α的稳定导致HIF1α和HIF1β的二聚体化，这使得HIF1复合物能够上调基因的转录以减轻这种压力。
[0015]为了调节基因表达，HIF1与低氧反应元件(HRE)结合，这些元件具有HIF结合位点(HBS)。HIF结合位点往往有一个共有序列NCGTG(SEQ ID NO:5)(等人，2011)。低氧反应元件可用于创建合成的低氧反应启动子，其在低氧条件下驱动目的产物的表达，而在常氧条件下则不能。低氧诱导型启动子已被探索用于基因治疗，特别是癌症治疗(Javan&Shanbazi，2017)。
[0016]本专利技术提供了合成的低氧诱导型生物处理启动子，它克服了目前在生物处理应用中使用的诱导型启动子的相关缺点。
[0017]基因治疗和生物处理中对诱导剂的要求有些不同。在基因治疗中，最重要的是诱导剂要对人体安全无毒，并能渗透各种组织。在生物处理中，诱导剂必须适合于在细胞培养物中的分布，而且如果其在最终产物中的存在是不想要的，优选容易洗掉或以其他方式去除。本专利技术的目的是提供可由AC激活或低氧来诱导的合成启动子，它可以被适合基因治疗的诱导剂和适合生物处理的诱导剂两者激活。

技术实现思路

[0018]根据本专利技术的第一方面，提供了一种合成的佛司可林诱导型顺式调控元件(CRE)，它能够被CREB和/或AP1结合。
[0019]虽然该CRE被称为佛司可林诱导型的，但它也可以被其他试剂诱导，这一点在下文有更详细的讨论。佛司可林的诱导机制是通过激活腺苷酸环化酶和随之而来的细胞内cAMP
的增加。因此，CRE也可被腺苷酸环化酶的其他激活剂或增加细胞内cAMP的因子所诱导。
[0020]优选地，CRE包括CREB和/或AP1的至少2个、更优选地至少3个转录因子结合位点(TFBS)(如本文所用，术语“X的TFBS”是指能够被转录因子X结合的TFBS)。
[0021]优选地，CRE包括CREB和/或AP1的至少4个TFBS。适当地，CRE包括CREB和/或AP1的3、4、5、6、7、8、9、本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种合成的可诱导的顺式调控元件(CRE)，其能够被CREB、AP1和/或HIF结合。2.根据权利要求1所述的合成的可诱导的顺式调控元件(CRE)，其中所述CRE是佛司可林诱导的，并且能够被CREB和/或AP1结合。3.根据权利要求2所述的合成的佛司可林诱导的CRE，其中所述CRE包括CREB和/或AP1的至少1个、可选的至少2、3、4个或更多个转录因子结合位点(TFBS)。4.根据权利要求2所述的合成的佛司可林诱导的CRE，其中所述CRE包括CREB和AP1中的每一个的至少1个TFBS。5.根据权利要求4所述的合成的佛司可林诱导的CRE，其中CREB的TFBS包括cAMPRE(SEQ ID NO:1)或由其组成。6.根据权利要求4所述的合成的佛司可林诱导的CRE，其中AP1的TFBS包括AP1共有序列(SEQ ID NO:2)、AP1(1)(SEQ ID NO:3)、AP1(3)(SEQ ID NO:43)和/或AP1(2)(SEQ ID NO:4)或由其组成。7.根据前述任一权利要求所述的合成的佛司可林诱导的CRE，其中所述CRE包括除CREB和/或AP1之外的转录因子的至少一个TFBS。8.根据前述任一权利要求所述的合成的佛司可林诱导的CRE，其中所述CRE包括ATF6和/或HIF的至少一个TFBS。9.根据权利要求8所述的合成的佛司可林诱导的CRE，其中HIF的TFBS包括共有序列NCGTG(SEQ ID NO:5)或HRE1(SEQ ID NO:7)或由其组成。10.根据权利要求8或9所述的合成的佛司可林诱导的CRE，其中ATF6的TFBS包括共有序列TGACGT(SEQ ID NO:10)、可选的TGACGTG(SEQ ID NO:11)或由共有序列TGACGT(SEQ ID NO:10)、可选的TGACGTG(SEQ ID NO:11)组成。11.根据前述任一权利要求所述的合成的佛司可林诱导的CRE，其中所述CRE包括：
‑
CREB的5个TFBS和AP1的3个TFBS；
‑
CREB的5个TFBS和AP1的4个TFBS；
‑
AP1的8个TFBS；
‑
ATF6的3个TFBS、AP1的4个TFBS和HIF的2个TFBS；
‑
CREB的7个TFBS和AP1的6个TFBS；或
‑
ATF6的5个TFBS、AP1的6个TFBS和HIF的6个TFBS。12.根据前述任一权利要求所述的合成的佛司可林诱导的CRE，其中相邻TFBS被间隔区序列分隔开。13.根据权利要求2所述的合成的佛司可林诱导的CRE，其中所述CRE包括序列TGACGTCA
‑
S
‑
TGACGTCA
‑
S
‑
TGACGTCA
‑
S
‑
TGACGTCA
‑
S
‑
TGACGTCA
‑
S
‑
TGACTCAG
‑
S
‑
TGACTCAG
‑
S
‑
TGACTCAG(SEQ ID NO:18)，其中S代表可选的间隔区序列。14.根据权利要求2所述的合成的佛司可林诱导的CRE，其中所述CRE包括序列TGACGTCA
‑
S
‑
TGACGTCA
‑
S
‑
TGACGTCA
‑
S
‑
TGACGTCA
‑
S
‑
TGACGTCA
‑
S
‑
TGACTCAG
‑
S
‑
TGACTCAG
‑
S
‑
TGACTCAG
‑
S
‑
TGACTCAG(SEQ ID NO:19)，其中S代表可选的间隔区序列。15.根据权利要求2所述的合成的佛司可林诱导的CRE，其中所述CRE包括序列TGAGTCA
‑
S
‑
TGAGTCA
‑
S
‑
TGAGTCA
‑
S
‑
TGAGTCA
‑
S
‑
TGAGTCA
‑
S
‑
TGAGTCA
‑
S
‑
TGAGTCA
‑
S
‑
TGAGTCA(SEQ ID NO:20)，其中S代表可选的间隔区序列。
16.根据权利要求2所述的合成的佛司可林诱导的CRE，其中所述CRE包括序列TGACGTGCT
‑
S
‑
TGACGTGCT
‑
S
‑
TGACGTGCT
‑
S
‑
TGAGTCA
‑
S
‑
TGAGTCA
‑
S
‑
TGAGTCA
‑
S
‑
TGAGTCA
‑
S
‑
CTGCACGTA
‑
S
‑
CTGCACGTA
‑
S
‑
CTGCACGTA(SEQ ID NO:21)，其中S代表可选的间隔区序列。17.根据权利要求2所述的合成的佛司可林诱导的CRE，其中所述CRE包括序列TGACGTCA
‑
S
‑
TGACGTCA
‑
S
‑
TGACGTCA
‑
S
‑
TGACGTCA
‑
S
‑
TGACGTCA
‑
S
‑
TGACTCA
‑
S
‑
TGACTCA
‑
S
‑
TGACTCA
‑
S
‑
TGACTCA(SEQ ID NO:22)，其中S代表可选的间隔区序列。18.根据权利要求2所述的合成的佛司可林诱导的CRE，其中所述CRE包括序列TGACGTCA
‑
S
‑
TGACGTCA
‑
S
‑
TGACGTCA
‑
S
‑
TGACGTCA
‑
S
‑
TGACGTCA
‑
S
‑
TGACGTCA
‑
S
‑
TGACGTCA
‑
S
‑
TGACTCA
‑
S
‑
TGACTCA
‑
S
‑
TGACTCA
‑
S
‑
TGACTCA
‑
S
‑
TGACTCA
‑
S
‑
TGACTCA(SEQ ID NO:58)，其中S代表可选的间隔区序列。19.根据权利要求2所述的合成的佛司可林诱导的CRE，其中所述CRE包括序列TGACGTGCT
‑
S
‑
TGACGTGCT
‑
S
‑
TGACGTGCT
‑
S
‑
TGACGTGCT
‑
S
‑
TGACGTGCT
‑
S
‑
TGAGTCA
‑
S
‑
TGAGTCA
‑
S
‑
TGAGTCA
‑
S
‑
TGAGTCA
‑
S
‑
TGAGTCA
‑
S
‑
TGAGTCA
‑
S
‑
CTGCACGTA
‑
S
‑
CTGCACGTA
‑
S
‑
CTGCACGTA
‑
S
‑
CTGCACGTA
‑
S
‑
CTGCACGTA
‑
S
‑
CTGCACGTA(SEQ ID NO:59)，其中S代表可选的间隔区序列。20.根据权利要求2所述的合成的佛司可林诱导的CRE，其中所述CRE包括序列TGACGTCA
‑
S
‑
TGACGTCA
‑
S
‑
TGACGTCA
‑
S
‑
TGACGTCA
‑
S
‑
TGACGTCA
‑
S
‑
TGACGTCA
‑
S
‑
TGACGTCA
‑
S
‑
TGACTCA
‑
S
‑
TGACTCA
‑
S
‑
TGACTCA
‑
S
‑
TGACTCA
‑
S
‑
TGACTCA
‑
S
‑
TGACTCA(SEQ ID NO:58)和TGACGTGCT
‑
S
‑
TGACGTGCT
‑
S
‑
TGACGTGCT
‑
S
‑
TGACGTGCT
‑
S
‑
TGACGTGCT
‑
S
‑
TGAGTCA
‑
S
‑
TGAGTCA
‑
S
‑
TGAGTCA
‑
S
‑
TGAGTCA
‑
S
‑
TGAGTCA
‑
S
‑
TGAGTCA
‑
S
‑
CTGCACGTA
‑
S
‑
CTGCACGTA
‑
S
‑
CTGCACGTA
‑
S
‑
CTGCACGTA
‑
S
‑
CTGCACGTA
‑
S
‑
CTGCACGTA(SEQ ID NO:59)，其中S代表可选的间隔区序列。21.根据权利要求2所述的合成的佛司可林诱导的CRE，其中所述CRE包括以下序列之一：
‑
TGACGTCACGATTACCATTGACGTCACGATTACCATTGACGTCACGATTACCATTGACGTCACGATTACCATTGACGTCAGCGATTAAGATGACTCAGCGATTAAGATGACTCAGCGATTAAGATGACTCAG(SEQ ID NO:23)；
‑
TGACGTCACGATTACCATTGACGTCACGATTACCATTGACGTCACGATTACCATTGACGTCACGATTACCATTGACGTCAGCGATTAAGATGACTCAGCGATTAAGATGACTCAGCGATTAAGATGACTCAGCGATTAAGATGACTCAG(SEQ ID NO:24)；
‑
TGAGTCAGATGATGCGTAGCTAGTAGTTGAGTCAGATGATGCGTAGCTAGTAGTTGAGTCAGATGATGCGTAGCTAGTAGTTGAGTCAGATGATGCGTAGCTAGTAGTTGAGTCAGATGATGCGTAGCTAGTAGTTGAGTCAGATGATGCGTAGCTAGTAGTTGAGTCAGATGATGCGTAGCTAGTAGTTGAGTCA(SEQ ID NO:25)；
‑
TGACGTGCTGATGATGCGTAGCTAGTAGTTGACGTGCTGATGATGCGTAGCTAGTAGTTGACGTGCTGATGATGCGTAGCTAGTAGTTGAGTCAGATGATGCGTAGCTAGTAGTTGAGTCAGATGATGCGTAGCTAGTAGTTGAGTC
AGATGATGCGTAGCTAGTAGTTGAGTCAGATGATGCGTAGCTAGTAGTCTGCACGTAGATGATGCGTAGCTAGTAGTCTGCACGTAGATGATGCGTAGCTAGTAGTCTGCACGTA(SEQ ID NO:26)；
‑
TGACGTCACGATTACCATTGACGTCACGATTACCATTGACGTCACGATTACCATTGACGTCACGATTACCATTGACGTCAGCGATTAAGATGACTCAGCGATTAAGATGACTCAGCGATTAAGATGACTCAGCGATTAAGATGACTCA(SEQ ID NO:27)；
‑
AATAAAATATCTTTATTTTCATTACATCTGTGTGTTGGTTTTTTGTGTGCCATTGACGTCACGATTTGACGTCAACCATTGACGTCACGATTTGACGTCAACCATTGACGTCACGATTTGACGTCACGATTTGACGTCAACCATTGACTCACGATTTGACTCAACCATTGACTCACGATTTGACTCAACCATTGACTCACGATTTGACTCACGATT(SEQ ID NO:60)；和
‑
AATAAAATATCTTTATTTTCATTACATCTGTGTGTTGGTTTTTTGTGTGTGACGTGCTgataatgcgtTGACGTGCTtgcgtgataaTGACGTGCTgataatgcgtTGACGTGCTtgcgtgataaTGACGTGCTagctagtagtTGAGTCAgataatgcgtTGAGTCAtgcgtgataaTGAGTCAgataatgcgtTGAGTCAtgcgtgataaTGAGTCAgataatgcgtTGAGTCAagctagtagtCTGCACGTAgataatgcgtCTGCACGTAtgcgtgataaCTGCACGTAgataatgcgtCTGCACGTAtgcgtgataaCTGCACGTAgataatgcgtCTGCACGTAagctagtagttgatctga(SEQ ID NO:61)；或任何所述序列的功能变体，所述功能变体包括与所述序列至少80％相同的序列。22.一种顺式调控模块，其包括至少一个根据权利要求2至21中任一项所述的合成的佛司可林诱导的顺式调控元件(CRE)。23.一种合成的佛司可林诱导型启动子，其包括至少一个根据权利要求2至21中任一项所述的CRE或至少一个根据权利要求22所述的CRM。24.根据权利要求23所述的合成的佛司可林诱导型启动子，其包括，至少一个根据权利要求2至21中任一项所述的CRE或至少一个根据权利要求22所述的CRM与最小启动子可操作地连接。25.根据权利要求23或24所述的合成的佛司可林诱导型启动子，其包括以下结构之一：
‑
cAMPRE
‑
S
‑
cAMPRE
‑
S
‑
cAMPRE
‑
S
‑
cAMPRE
‑
S
‑
cAMPRE
‑
S
‑
AP1
‑
S
‑
AP1
‑
S
‑
AP1
‑
S
‑
MP；
‑
cAMPRE
‑
S
‑
cAMPRE
‑
S
‑
cAMPRE
‑
S
‑
cAMPRE
‑
S
‑
cAMPRE
‑
S
‑
AP1
‑
S
‑
AP1
‑
S
‑
AP1
‑
S
‑
AP1
‑
S
‑
MP；
‑
AP1
‑
S
‑
AP1
‑
S
‑
AP1
‑
S
‑
AP1
‑
S
‑
AP1
‑
S
‑
AP1
‑
S
‑
AP1
‑
S
‑
AP1
‑
S
‑
MP；和
‑
ATF6
‑
S
‑
ATF6
‑
S
‑
ATF6
‑
S
‑
AP1
‑
S
‑
AP1
‑
S
‑
AP1
‑
S
‑
AP1
‑
S
‑
HIF
‑
S
‑
HIF
‑
S
‑
HIF
‑
S
‑
MP；
‑
cAMPRE
‑
S
‑
cAMPRE
‑
S
‑
cAMPRE
‑
S
‑
cAMPRE
‑
S
‑
cAMPRE
‑
S
‑
cAMPRE
‑
S
‑
cAMPRE
‑
S
‑
AP1
‑
S
‑
AP1
‑
S
‑
AP1
‑
S
‑
AP1
‑
S
‑
AP1
‑
S
‑
AP1
‑
S
‑
MP；和
‑
ATF6
‑
S
‑
ATF6
‑
S
‑
ATF6
‑
S
‑
ATF6
‑
S
‑
ATF6
‑
S
‑
AP1
‑
S
‑
AP1
‑
S
‑
AP1
‑
S
‑
AP1
‑
S
‑
AP1
‑
S
‑
AP1
‑
S
‑
HIF
‑
S
‑
HIF
‑
S
‑
HIF
‑
S
‑
HIF
‑
S
‑
HIF
‑
S
‑
HIF
‑
S
‑
MP；其中S代表可选的但优选的间隔区序列，MP代表最小启动子。26.根据权利要求23至25中任一项所述的合成的佛司可林诱导型启动子，其包括以下结构之一：
‑
cAMPRE
‑
S
‑
cAMPRE
‑
S
‑
cAMPRE
‑
S
‑
cAMPRE
‑
S
‑
cAMPRE
‑
S
‑
AP1
‑
S
‑
AP1
‑
S
‑
AP1
‑
S
‑
SV40
‑
MP；
‑
cAMPRE
‑
S
‑
cAMPRE
‑
S
‑
cAMPRE
‑
S
‑
cAMPRE
‑
S
‑
cAMPRE
‑
S
‑
AP1
‑
S
‑
AP1
‑
S
‑
AP1
‑
S
‑
AP1
‑
S
‑
CMV
‑
MP；
‑
AP1
‑
S
‑
AP1
‑
S
‑
AP1
‑
S
‑
AP1
‑
S
‑
AP1
‑
S
‑
AP1
‑
S
‑
AP1
‑
S
‑
AP1
‑
S
‑
(Min
‑
TK或G6PCMP或CMV
‑
MP)；
‑
ATF6
‑
S
‑
ATF6
‑
S
‑
ATF6
‑
S
‑
AP1
‑
S
‑
AP1
‑
S
‑
AP1
‑
S
‑
AP1
‑
S
‑
HIF
‑
S
‑
HIF
‑
S
‑
HIF
‑
S
‑
CMV
‑
MP；
‑
cAMPRE
‑
S
‑
cAMPRE
‑
S
‑
cAMPRE
‑
S
‑
cAMPRE
‑
S
‑
cAMPRE
‑
S
‑
AP1
‑
S
‑
AP1
‑
S
‑
AP1
‑
S
‑
AP1
‑
S
‑
YB
‑
TATA；
‑
cAMPRE
‑
S
‑
cAMPRE
‑
S
‑
cAMPRE
‑
S
‑
cAMPRE
‑
S
‑
cAMPRE
‑
S
‑
cAMPRE
‑
S
‑
cAMPRE
‑
S
‑
AP1
‑
S
‑
AP1
‑
S
‑
AP1
‑
S
‑
AP1
‑
S
‑
AP1
‑
S
‑
AP1
‑
S
‑
(YB
‑
Tata，短CMV，CMV53，MinTK，MLP，SV40，pJB42或TATAm6a MP)；和
‑
ATF6
‑
S
‑
ATF6
‑
S
‑
ATF6
‑
S
‑
ATF6
‑
S
‑
ATF6
‑
S
‑
AP1
‑
S
‑
AP1
‑
S
‑
AP1
‑
S
‑
AP1
‑
S
‑
AP1
‑
S
‑
AP1
‑
S
‑
HIF
‑
S
‑
HIF
‑
S
‑
HIF
‑
S
‑
HIF
‑
S
‑
HIF
‑
S
‑
HIF
‑
S
‑
(YB
‑
Tata，短CMV，CMV53，MinTK，MLP，SV40，pJB42或TATAm6a MP)；其中S代表可选的但优选的间隔区序列。27.根据权利要求23至26中任一项所述的合成的佛司可林诱导型启动子，其包括以下序列之一：
‑
TGACGTCA
‑
S
‑
TGACGTCA
‑
S
‑
TGACGTCA
‑
S
‑
TGACGTCA
‑
S
‑
TGACGTCA
‑
S
‑
TGA[GC]TCA
‑
S
‑
TGA[GC]TCA
‑
S
‑
TGA[GC]TCA
‑
S
‑
TGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATCGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCGGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAA(SEQ ID NO:51)；
‑
TGACGTCA
‑
S
‑
TGACGTCA
‑
S
‑
TGACGTCA
‑
S
‑
TGACGTCA
‑
S
‑
TGACGTCA
‑
S
‑
TGA[GC]TCA
‑
S
‑
TGA[GC]TCA
‑
S
‑
TGA[GC]TCA
‑
S
‑
TGA[GC]TCA
‑
S
‑
AGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTAGATACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGATCGCCACC(SEQ ID NO:52)；
‑
TGA[GC]TCA
‑
S
‑
TGA[GC]TCA
‑
S
‑
TGA[GC]TCA
‑
S
‑
TGA[GC]TCA
‑
S
‑
TGA[GC]TCA
‑
S
‑
TGA[GC]TCA
‑
S
‑
TGA[GC]TCA
‑
S
‑
TGA[GC]TCA
‑
S
‑
(TTCGCATATTAAGGTGACGCGTGTGGCCTCGAACACCGAGCGACCCTGCAGCGACCCGCTTAA(SEQ ID NO:53)或GGGCATATAAAACAGGGGCAAGGCACAGACTCATAGCAGAGCAATCACCACCAAGCCTGGAATAACTGCAGCCACC(SEQ ID NO:54)或AGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTAGATACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGATCGCCACC)(SEQ ID NO:55)；
‑
TGACGT
‑
S
‑
TGACGT
‑
S
‑
TGACGT
‑
S
‑
TGA[GC]TCA
‑
S
‑
TGA[GC]TCA
‑
S
‑
TGA[GC]TCA
‑
S
‑
TGA[GC]TCA
‑
S
‑
[AG]CGTG
‑
S
‑
[AG]CGTG
‑
S
‑
[AG]CGTG
‑
S
‑
AGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTAGATACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGATCGCCACC(SEQ ID NO:56)；
‑
TGACGTCA
‑
S
‑
TGACGTCA
‑
S
‑
TGACGTCA
‑
S
‑
TGACGTCA
‑
S
‑
TGACGTCA
‑
S
‑
TGA[GC]TCA
‑
S
‑
TGA[GC]TCA
‑
S
‑
TGA[GC]TCA
‑
S
‑
TGA[GC]TCA
‑
S
‑
GCGATTAATCCATATGCTCTAGAGGGTATATAATGGGGGCCACTAGTCTACTACCAGAAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCAGCCACC(SEQ ID NO:17)；
‑
TGACGTCA
‑
S
‑
TGACGTCA
‑
S
‑
TGACGTCA
‑
S
‑
TGACGTCA
‑
S
‑
TGACGTCA
‑
S
‑
TGACGTCA
‑
S
‑
TGACGTCA
‑
S
‑
TGA[GC]TCA
‑
S
‑
TGA[GC]TCA
‑
S
‑
TGA[GC]TCA
‑
S
‑
TGA[GC]TCA
‑
S
‑
TGA[GC]TCA
‑
S
‑
TGA[GC]TCA
‑
S
‑
GCGATTAATCCATATGCTCTAGAGGGTATATAATGGGGGCCACTAGTCTACTACCAGAAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCAGCCACC(SEQ ID NO:83)；
‑
TGACGTCA
‑
S
‑
TGACGTCA
‑
S
‑
TGACGTCA
‑
S
‑
TGACGTCA
‑
S
‑
TGACGTCA
‑
S
‑
TGACGTCA
‑
S
‑
TGACGTCA
‑
S
‑
TGA[GC]TCA
‑
S
‑
TGA[GC]TCA
‑
S
‑
TGA[GC]TCA
‑
S
‑
TGA[GC]TCA
‑
S
‑
TGA[GC]TCA
‑
S
‑
TGA[GC]TCA
‑
S
‑
GTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCT(SEQ ID NO:84)；
‑
TGACGTCA
‑
S
‑
TGACGTCA
‑
S
‑
TGACGTCA
‑
S
‑
TGACGTCA
‑
S
‑
TGACGTCA
‑
S
‑
TGACGTCA
‑
S
‑
TGACGTCA
‑
S
‑
TGA[GC]TCA
‑
S
‑
TGA[GC]TCA
‑
S
‑
TGA[GC]TCA
‑
S
‑
TGA[GC]TCA
‑
S
‑
TGA[GC]TCA
‑
S
‑
TGA[GC]TCA
‑
S
‑
AAGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCT(SEQ ID NO:85)；
‑
TGACGTCA
‑
S
‑
TGACGTCA
‑
S
‑
TGACGTCA
‑
S
‑
TGACGTCA
‑
S
‑
TGACGTCA
‑
S
‑
TGACGTCA
‑
S
‑
TGACGTCA
‑
S
‑
TGA[GC]TCA
‑
S
‑
TGA[GC]TCA
‑
S
‑
TGA[GC]TCA
‑
S
‑
TGA[GC]TCA
‑
S
‑
TGA[GC]TCA
‑
S
‑
TGA[GC]TCA
‑
S
‑
TTCGCATATTAAGGTGACGCGTGTGGCCTCGAACACCGAGCGACCCTGCAGCGACCCGCTTAA(SEQ ID NO:86)；
‑
TGACGTCA
‑
S
‑
TGACGTCA
‑
S
‑
TGACGTCA
‑
S
‑
TGACGTCA
‑
S
‑
TGACGTCA
‑
S
‑
TGACGTCA
‑
S
‑
TGACGTCA
‑
S
‑
TGA[GC]TCA
‑
S
‑
TGA[GC]TCA
‑
S
‑
TGA[GC]TCA
‑
S
‑
TGA[GC]TCA
‑
S
‑
TGA[GC]TCA
‑
S
‑
TGA[GC]TCA
‑
S
‑
GGGGGGCTATAAAAGGGGGTGGGGGCGTTCGTCCTCACTCT(SEQ ID NO:87)；
‑
TGACGTCA
‑
S
‑
TGACGTCA
‑
S
‑
TGACGTCA
‑
S
‑
TGACGTCA
‑
S
‑
TGACGTCA
‑
S
‑
TGACGTCA
‑
S
‑
TGACGTCA
‑
S
‑
TGA[GC]TCA
‑
S
‑
TGA[GC]TCA
‑
S
‑
TGA[GC]TCA
‑
S
‑
TGA[GC]TCA
‑
S
‑
TGA[GC]TCA
‑
S
‑
TGA[GC]TCA
‑
S
‑
TGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATCGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCGGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAA(SEQ IDNO:88)；
‑
TGACGTCA
‑
S
‑
TGACGTCA
‑
S
‑
TGACGTCA
‑
S
‑
TGACGTCA
‑
S
‑
TGACGTCA
‑
S
‑
TGACGTCA
‑
S
‑
TGACGTCA
‑
S
‑
TGA[GC]TCA
‑
S
‑
TGA[GC]TCA
‑
S
‑
TGA[GC]TCA
‑
S
‑
TGA[GC]TCA
‑
S
‑
TGA[GC]TCA
‑
S
‑
TGA[GC]TCA
‑
S
‑
CTGACAAATTCAGTATAAAAGCTTGGGGCTGGGGCCGAGCACTGGGGACTTTGAGGGTGGCCAGGCCAGCGTAGGAGGCCAGCGTAGGATCCTGCTGGGAGCGGGGAACTGAGGGAAGCGACGCCGAGAAAGCAGGCGTACCACGGAGGGAGAGAAAAGCTCCGGAAGCCCAGCAGCG(SEQ ID NO:89)；
‑
TGACGTCA
‑
S
‑
TGACGTCA
‑
S
‑
TGACGTCA
‑
S
‑
TGACGTCA
‑
S
‑
TGACGTCA
‑
S
‑
TGACGTCA
‑
S
‑
TGACGTCA
‑
S
‑
TGA[GC]TCA
‑
S
‑
TGA[GC]TCA
‑
S
‑
TGA[GC]TCA
‑
S
‑
TGA[GC]TCA
‑
S
‑
TGA[GC]TCA
‑
S
‑
TGA[GC]TCA
‑
S
‑
TATAAAAGGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGaagcttggactaaagcggact(SEQ ID NO:90)；
‑
TGACGT
‑
S
‑
TGACGT
‑
S
‑
TGACGT
‑
S
‑
TGACGT
‑
S
‑
TGACGT
‑
S
‑
TGA[GC]TCA
‑
S
‑
TGA[GC]TCA
‑
S
‑
TGA[GC]TCA
‑
S
‑
TGA[GC]TCA
‑
S
‑
TGA[GC]TCA
‑
S
‑
TGA[GC]TCA
‑
S
‑
[AG]CGTG
‑
S
‑
[AG]CGTG
‑
S
‑
[AG]CGTG
‑
S
‑
[AG]CGTG
‑
S
‑
[AG]CGTG
‑
S
‑
[AG]CGTG
‑
S
‑
GCGATTAATCCATATGCTCTAGAGGGTATATAATGGGGGCCACTAGTCTACTACCAGAAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCAGCCACC(SEQ ID NO:91)；
‑
TGACGT
‑
S
‑
TGACGT
‑
S
‑
TGACGT
‑
S
‑
TGACGT
‑
S
‑
TGACGT
‑
S
‑
TGA[GC]TCA
‑
S
‑
TGA[GC]TCA
‑
S
‑
TGA[GC]TCA
‑
S
‑
TGA[GC]TCA
‑
S
‑
TGA[GC]TCA
‑
S
‑
TGA[GC]TCA
‑
S
‑
[AG]CGTG
‑
S
‑
[AG]CGTG
‑
S
‑
[AG]CGTG
‑
S
‑
[AG]CGTG
‑
S
‑
[AG]CGTG
‑
S
‑
[AG]CGTG
‑
S
‑
GTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCT(SEQ ID NO:92)；
‑
TGACGT
‑
S
‑
TGACGT
‑
S
‑
TGACGT
‑
S
‑
TGACGT
‑
S
‑
TGACGT
‑
S
‑
TGA[GC]TCA
‑
S
‑
TGA[GC]TCA
‑
S
‑
TGA[GC]TCA
‑
S
‑
TGA[GC]TCA
‑
S
‑
TGA[GC]TCA
‑
S
‑
TGA[GC]TCA
‑
S
‑
[AG]CGTG
‑
S
‑
[AG]CGTG
‑
S
‑
[AG]CGTG
‑
S
‑
[AG]CGTG
‑
S
‑
[AG]CGTG
‑
S
‑
[AG]CGTG
‑
S
‑
AAGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCT(SEQ ID NO:93)；
‑
TGACGT
‑
S
‑
TGACGT
‑
S
‑
TGACGT
‑
S
‑
TGACGT
‑
S
‑
TGACGT
‑
S
‑
TGA[GC]TCA
‑
S
‑
TGA[GC]TCA
‑
S
‑
TGA[GC]TCA
‑
S
‑
TGA[GC]TCA
‑
S
‑
TGA[GC]TCA
‑
S
‑
TGA[GC]TCA
‑
S
‑
[AG]CGTG
‑
S
‑
[AG]CGTG
‑
S
‑
[AG]CGTG
‑
S
‑
[AG]CGTG
‑
S
‑
[AG]CGTG
‑
S
‑
[AG]CGTG
‑
S
‑
TTCGCATATTAAGGTGACGCGTGTGGCCTCGAACACCGAGCGACCCTGCAGCGACCCGCTTAA(SEQ ID NO:94)；
‑
TGACGT
‑
S
‑
TGACGT
‑
S
‑
TGACGT
‑
S
‑
TGACGT
‑
S
‑
TGACGT
‑
S
‑
TGA[GC]TCA
‑
S
‑
TGA[GC]TCA
‑
S
‑
TGA[GC]TCA
‑
S
‑
TGA[GC]TCA
‑
S
‑
TGA[GC]TCA
‑
S
‑
TGA[GC]TCA
‑
S
‑
[AG]CGTG
‑
S
‑
[AG]CGTG
‑
S
‑
[AG]CGTG
‑
S
‑
[AG]CGTG
‑
S
‑
[AG]CGTG
‑
S
‑
[AG]CGTG
‑
S
‑
GGGGGGCTATAAAAGGGGGTGGGGGCGTTCGTCCTCACTCT(SEQ ID NO:95)；
‑
TGACGT
‑
S
‑
TGACGT
‑
S
‑
TGACGT
‑
S
‑
TGACGT
‑
S
‑
TGACGT
‑
S
‑
TGA[GC]TCA
‑
S
‑
TGA[GC]TCA
‑
S
‑
TGA[GC]TCA
‑
S
‑
TGA[GC]TCA
‑
S
‑
TGA[GC]TCA
‑
S
‑
TGA[GC]TCA
‑
S
‑
[AG]CGTG
‑
S
‑
[AG]CGTG
‑
S
‑
[AG]CGTG
‑
S
‑
[AG]CGTG
‑
S
‑
[AG]CGTG
‑
S
‑
[AG]CGTG
‑
S
‑
TGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATCGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCGGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAA(SEQ ID NO:96)；
‑
TGACGT
‑
S
‑
TGACGT
‑
S
‑
TGACGT
‑
S
‑
TGACGT
‑
S
‑
TGACGT
‑
S
‑
TGA[GC]TCA
‑
S
‑
TGA[GC]TCA
‑
S
‑
TGA[GC]TCA
‑
S
‑
TGA[GC]TCA
‑
S
‑
TGA[GC]TCA
‑
S
‑
TGA[GC]TCA
‑
S
‑
[AG]CGTG
‑
S
‑
[AG]CGTG
‑
S
‑
[AG]CGTG
‑
S
‑
[AG]CGTG
‑
S
‑
[AG]CGTG
‑
S
‑
[AG]CGTG
‑
S
‑
CTGACAAATTCAGTATAAAAGCTTGGGGCTGGGGCCGAGCACTGGGGACTTTGAGGGTGGCCAGGCCAGCGTAGGAGGCCAGCGTAGGATCCTGCTGGGAGCGGGGAACTGAGGGAAGCGACGCCGAGAAAGCAGGCGTACCACGGAGGGAGAGAAAAGCTCCGGAAGCCCAGCAGCG(SEQ ID NO:97)；
‑
TGACGT
‑
S
‑
TGACGT
‑
S
‑
TGACGT
‑
S
‑
TGACGT
‑
S
‑
TGACGT
‑
S
‑
TGA[GC]TCA
‑
S
‑
TGA[GC]TCA
‑
S
‑
TGA[GC]TCA
‑
S
‑
TGA[GC]TCA
‑
S
‑
TGA[GC]TCA
‑
S
‑
TGA[GC]TCA
‑
S
‑
[AG]CGTG
‑
S
‑
[AG]CGTG
‑
S
‑
[AG]CGTG
‑
S
‑
[AG]CGTG
‑
S
‑
[AG]CGTG
‑
S
‑
[AG]CGTG
‑
S
‑
TATAAAAGGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGaa...

【专利技术属性】
技术研发人员：格雷厄姆，
申请(专利权)人：阿斯克肋匹奥生物制药公司，
类型：发明
国别省市：