重组AAV的生产制造技术

本申请公开产生缺乏原核序列的高滴度重组腺相关病毒(rAAV)的群体的方法。组腺相关病毒(rAAV)的群体的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】重组AAV的生产
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请请求依据35 U.S.C.
§
119(e)于2020年1月17日提交的美国临时申请第62/962,911号的权益，其整体内容通过引用并入本文中。


[0003]本公开有关缺乏原核序列的重组腺相关病毒(recombinant adeno
‑
associated virus，rAAV)病毒粒子(virion)的生产。

技术介绍

[0004]尽管经过多年的研究，目前生产rAAV的方法仍然很昂贵。目前常见为约105个基因组拷贝数(GC)/细胞的生产速率，结果为10
14
GC/L(mKotin RM.Large
‑
scale recombinant adeno
‑
associated virus production.Hum Mol Genet.2011；20(R1):R2
–
R6.doi:10.1093/hmg/ddr141)。虽然这已经证明足以支持早期临床试验，且可为小患者群体适应症提供上市产品，但此平台的可扩展性缺陷为一个重大限制(Clement N,Grieger JC.Manufacturing of recombinant adeno
‑
associated viral vectors for clinical trials.Mol Ther Methods Clin Dev.2016；3:16002.doi:10.1038/mtm.2016.2；Wright JF.manufacturing and characterizing AAV
‑
based vectors for use in clinical studies.Gene Ther.2008；15(11):840
–
848.doi:10.1038/gt.2008.65)。可推测的是，成功地将三个质粒递送至一个细胞为一个相对低效率的过程。对于更大规模的制造工作，质粒的瞬时递送需要过量的DNA，增加生产和纯化的总成本。此外，于辅助基因存在下瞬时传递rep/cap基因亦可能导致产品异质性，包括缺乏转基因的AAV载体。这些“空衣壳(empty capsids)”代表瞬时转染试验中所产生的很大一部分病毒。因此，开发可靠的分析质量控制(QC)方法以确保生产批次之间的相似性至关重要。

技术实现思路

[0005]本专利技术的实施方案涉及缺乏原核序列的重组腺相关病毒(rAAV)载体的封闭线性大规模生产。
[0006]在一个方面，本文提供一种生产重组腺相关病毒(rAAV)的方法。一般而言，所述方法包括于培养基中以a)编码足以用于rAAV复制的辅助蛋白的核酸序列；b)编码AAV rep和AAV cap基因的核酸序列，和c)包含至少一个反向末端重复(inverted terminal repeat，ITR)序列和可操作地连接到一个或多个调节元件的异源转基因的封闭末端线性双链体rAAV载体核酸转染宿主细胞系；例如，培育经转染的宿主细胞系足够长的时间以产生rAAV；任选地，裂解转染的宿主细胞；以及，从培养基中分离/纯化rAAV。所述方法适用于生产高滴度的rAAV。因此，通过所述方法产生的rAAV滴度可以高于使用以相应量的包含相同异源转基因的质粒DNA(plasmid DNA，pDNA)转染的宿主细胞系产生的rAAV滴度。在特定实施方案中，来自a)、b)和c)的核酸总量小于约2μg每1
×
106个宿主细胞。在特定实施方案中，使用包
含a)、b)和c)以及聚阳离子聚合物的转染组合物转染宿主细胞，其中所述聚阳离子聚合物与来自a)、b)和c)的核酸总量的比例为约1：1至约3：1(重量/重量)。在一些实施方案中，裂解所述经转染的宿主细胞。在一些其他实施方案中，不裂解所述经转染的细胞。
[0007]在特定实施方案中，通过本专利技术的方法产生的所述rAAV的滴度高于使用以相应量的包含异源转基因的质粒DNA转染的宿主细胞系所产生的rAAV的滴度。举例而言，相较于以相应量的质粒DNA获得的rAAV的滴度，通过本专利技术的方法产生的rAAV滴度为至少1.25倍，例如，1.5倍、1.75倍、2倍、2.25倍、2.5倍、2.75倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍或或更高。
[0008]在特定实施方案中，产生重组腺相关病毒(rAAV)的方法包括提供编码AAV核酸序列或封闭线性AAV核酸序列的载体；在悬浮液中培养人类胚胎细胞系；以所述编码AAV核酸序列的载体和转染组合物或以封闭线性AAV核酸序列和转染组合物转染人类细胞系；培育经转染的人类细胞系约40至400小时；任选地，裂解经转染的人类细胞系并纯化编码rAAV的核酸序列，从而产生rAAV。在实施方案的一些方面，裂解经转染的宿主细胞。在一些其他实施方案中，不裂解经转染的细胞。
[0009]在特定实施方案中，所述转染组合物包含：(i)编码腺病毒辅助蛋白的载体，(ii)包含AAV rep基因和AAV衣壳(cap)蛋白基因的载体，和(iii)包含AAV反向末端重复(ITR)序列的载体。在一些实施方案中，载体(i)至(iii)中的至少一种包含于封闭线性AAV核酸序列中。例如，载体(iii)包含在包括至少一个反向末端重复(ITR)序列和可操作地连接到一个或多个调节元件的异源转基因的封闭末端线性双链载体核酸中。
[0010]在特定实施方案中，所述编码腺病毒辅助蛋白的载体缺乏腺病毒结构和复制基因。在特定实施方案中，所述AAV rep和衣壳(cap)基因来自不同的血清型。在特定实施方案中，所述AAV rep和衣壳基因来自相同的血清型。AAV血清型的实例包括AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV13等。在特定实施方案中，所述AAV rep基因来自选自由AAV2、3、8、9和10所组成群组的血清型。在特定实施方案中，所述AAV cap基因来自选自由AAV2、3、8、9和10所组成群组的血清型。例如，所述AAV rep基因为AAV2rep基因，且所述AAV衣壳基因为AAV8衣壳基因。在特定实施方案中，所述AAV反向末端重复(ITR)序列为腺相关病毒2反向末端重复(ITR)序列。实际上可以使用任何其他组合的血清型。
[0011]在特定实施方案中，rAAV颗粒具有至少一个来自AAV血清型的AAV ITR，所述AAV血清型选自由AAV 1、2、3(例如，3a、3b)、4、5、6、7、8、9、10、11和13所组成群组。在特定实施方案中，AAV ITR来自选自由AAV2、3(例如，3a、3b)、8、9和10所组成群组的血清型。在特定实施方案中，AAV ITR和AAV cap基因来自不同的血清型。在特定实施方案中，AAV ITR和AAV cap基因来自相同的血清型。在一些实施方案中，AAV ITR是野生型、突变的或合成的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种产生缺乏原核序列的重组腺相关病毒(rAAV)的方法，包括：于悬浮液中培养人类胚胎细胞系；以a)编码足以用于rAAV复制的辅助蛋白的核酸序列；b)编码AAV rep和AAV cap基因的核酸序列，及c)包含至少一个反向末端重复(ITR)序列和可操作地连接到一个或多个调节元件的异源转基因的封闭末端线性双链rAAV载体核酸，转染所述人类胚胎细胞系；培育所述经转染的人类胚胎细胞系约40至400小时；以及任选地，裂解所述经转染的人类胚胎细胞系且纯化编码所述rAAV的核酸序列，从而产生rAAV。2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述细胞系的细胞于悬浮液中转染。3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述人类胚胎细胞系为源自人类胚胎肾细胞系的悬浮适应无血清细胞系。4.权利要求1所述的方法，其中，所述AAV rep基因和AAV cap基因来自不同的血清型。5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述AAV rep基因和AAV cap基因来自相同的血清型。6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述AAV rep基因为AAV2 rep基因且所述AAV cap基因为AAV8 cap基因。7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述AAV ITR和AAV cap基因来自不同的血清型。8.根据权利要求1所述的方法，其中，所述AAV ITR和AAV cap基因来自相同的血清型。9.根据权利要求1所述的方法，其中，所述AAV反向末端重复(ITR)序列为腺相关病毒2反向末端重复(ITR)序列。10.根据权利要求1所述的方法，其中，所述AAV ITR序列来自AAV2血清型或选自由AAV 1、3a、3b、4、5、6、7、8、9、10、11和13所组成群组的血清型。11.根据权利要求1所述的方法，其中，所述AAV ITR序列为合成的。12.根据权利要求1所述的方法，其中，从a)、b)和c)转染的核酸总量小于2μg每1
×
106个细胞，任选地，从a)、b)和c)转染的核酸总量小于1μg每1
×
106个细胞。13.根据权利要求1所述的方法，其中，a)：b)：c)的比例为约0.5至1.75：约0.75至2.25：约0.5至1.75(重量：重量：重量)，任选地，a)：b)：c)的比例为约1：约1至1.6：约1(重量：重量：重量)。14.根据权利要求1所述的方法，其中，a)、b)和c)使用包含a)、b)和c)以及稳定的阳离子聚合物的转染组合物进行转染，其中，所述稳定的阳离子聚合物与来自a)、b)和c)的核酸总量的比例为约1：1至约3：1(重量/重量)，任选地，所述稳定的阳离子聚合物与来自a)、b)和c)的核酸总量的比例约为1.5：1。15.根据权利要求1所述的方法，其中，各个a)、b)和c)于一个或多个封闭末端线性双链核酸分子上提供。16.根据权利要求1所述的方法，其中，经转染的核酸a)、b)和c)为合成核酸且没有DNA的真核和原核细胞修饰。17.根据权利要求1所述的方法，其中，所述编码足以用于rAAV复制的辅助蛋白的核酸序列包含编码腺病毒辅助(Ad辅助)蛋白的核苷酸序列，任选地，所述编码足以用于rAAV复制的辅助蛋白的核酸序列包含编码腺病毒辅助蛋白E2A和E4的核苷酸序列。
18.根据权利要求1所述的方法，其中，所述rAAV的滴度为至少9.3
×
10
13
个载体基因组/3.0
×
109个经转染的活细胞。19.根据权利要求1所述的方法，其中，于转染之前，以增加的体积逐渐培养所述人类胚胎细胞系的悬浮液。20.根据权利要求19所述的方法，其中，培养体积自约50ml体积逐渐增加至约2000公升体积。21.根据权利要求20所述的方法，其中，所述培养体积包含浓度为约1mM至约20mM的氨基酸。22.根据权利要求21所述的方法，其中，具有约5公升体积的培养基包含浓度为约10mM的氨基酸。23.根据权利要求21所述的方法，其中，所述氨基酸为L
‑
谷氨酰胺或L
‑
丙氨酰
‑
L
‑
谷氨酰胺(Glutamax
TM
)。24.根据权利要求20所述的方法，其中，具有约50公升体积的培养基包含：至少约1mM至约20mM的L
‑
谷氨酰胺、至少约0.01％至约1％的非离子表面活性剂多元醇或洗涤剂以及至少约0.001％至约1％的消泡剂。25.根据权利要求24所述的方法，其中，所述非离子表面活性剂多元醇包括普流尼克酸。26.根据权利要求1所述的方法，其中，所述培养的人类胚胎细胞系包含约3.0
×
106至约1
×
108个活细胞/ml的细胞密度。27.根据权利要求26所述的方法，其中，所述培养的人类胚胎细胞系包含约4.0
×
106至约6
×
106个活细胞/ml，或任选地至约2.5
×
107个活细胞/ml的细胞密度。28.根据权利要求1所述的方法，还包括：(i)加入约1公升的培养基至所述经转染的细胞中；以及(ii)于约10分钟至约60分钟的时间过程中，以聚合物与DNA为约1：1至聚合物与DNA为约3：1之间的比例添加阳离子聚合物。29.根据权利要求28所述的方法，其中，于约1分钟至约10分钟的时间过程中，以聚合物与DNA的比例为2.2：1的比例添加所述阳离子聚合物。30.根据权利要求28所述的方法，其中，所述阳离子聚合物包括完全水解的线性聚乙烯亚胺(PEI)。31.根据权利要求1所述的方法，其中，在转染前约12至36小时，将包含人类胚胎细胞悬浮液的培养基的温度升高至37℃。32.根据权利要求27所述的方法，其中，所述培养基经受约0.1LPM至约1.0LPM之间的流速的空气喷射。33.根据权利要求27所述的方法，其中，所述培养基经受约0.5LPM的流速的空气喷射。34.一种产生缺乏原核序列的高滴度重组腺相关病毒(rAAV)的群体的方法，包括：i)以a)编码足以用于rAAV复制的辅助蛋白的核酸序列；b)编码rep和cap基因的核酸序列，和c)包含至少一个ITR和可操作地连接到一个或多个调节元件的异源转基因的封闭末端线性双链rAAV载体核酸转染哺乳动物细胞系，其中，从a)、b)和c)转染的核酸总量小于1μg每1
×
106个细胞；ii)培养所述经转染的细胞至少24小时；
iii)收获所述经转染的细胞并纯化所产生的所述rAAV载体颗粒；其中，rAAV的滴度为至少9.3
×
10
13
个载体基因组/3.0
×
109个经转染的活细胞。35.根据权利要求34所述的方法，其中，所述哺乳动物细胞系为悬浮细胞系，且所述细胞于悬浮液中转染。36.根据权利要求34所述的方法，其中，所述细胞系源自人类胚胎肾细胞系。37.根据权利要求34至36中任一项所述的方法，其中，所述哺乳动物细胞系为悬浮适应无血清细胞系。38.根据权利要求34所述的方法，其中，a)：b)：c)的比例为约0.5至1.75：约0.75至2.25：约0.5至1.75(重量：重量：重量)，任选地，a)：b)：c)的比例为约1：约1至1.6：约1(重量：重量：重量)。39.根据权利要求34所述的方法，其中，使用包含a)、b)和c)以及稳定的阳离子聚合物的转染组合物转染a)、b)和c)，其中，稳定的阳离子聚合物与来自a)、b)和c)的核酸总量的比例为约1：1至约3：1(重量/重量)，任选地，稳定的阳离子聚合物与来自a)、b)和c)的核酸总量的比例为约1.5：1。40.根据权利要求34所述的方法，其中，各个a)、b)和c)于一个或多个封闭末端线性双链核酸分子上提供。41.根据权利要求34所述的方法，其中，经转染的核酸a)、b)和c)为合成核酸且没有DNA的真核和原核细胞修饰。42.根据权利要求34所述的方法，其中，a)编码足以用于rAAV复制的辅助蛋白的核酸序列包含编码Ad辅助蛋白的核苷酸序列，任选地，编码足以用于rAAV复制的辅助蛋白的核酸序列包含编码腺病毒辅助蛋白的核苷酸序列E2A和E4。43.根据权利要求34至42中任一项所述的方法，其中，来自a)、b)和c)的DNA总量任选地为0.6、0.7、0.75、0.8、0.9、1、1.2、1.4、1.6或1.8μg。44.根据权利要求34至43中任一项所述的方法，其中，在转染之前，以增加的体积的培养基中逐渐培养所述哺乳动物细胞系的悬浮液。45.根据...

【专利技术属性】
技术研发人员：J，
申请(专利权)人：阿斯克肋匹奥生物制药公司，
类型：发明
国别省市：