调节性核酸序列制造技术

本发明专利技术涉及调节性核酸序列，特别是CNS特异性启动子，以及其元件。本发明专利技术还涉及包含此类启动子的表达构建体、载体、病毒体、药物组合物和细胞以及它们的使用方法。所述调节性核酸序列对基因治疗应用特别有用。序列对基因治疗应用特别有用。序列对基因治疗应用特别有用。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】调节性核酸序列


[0001]本专利技术涉及调节性核酸序列，特别是中枢神经系统(CNS)特异性启动子，以及其元件。本专利技术还涉及包含此类启动子的表达构建体、载体、病毒体、药物组合物和细胞以及它们的使用方法。所述调节性核酸序列对基因治疗应用特别有用。

技术介绍

[0002]下面的讨论是为了帮助读者理解本公开，并不构成对现有技术的内容或相关性的任何承认。
[0003]在对体内基因调控的内部机制进行广泛研究后，研究重点最近转向了通过将外源核酸序列引入细胞来调控基因表达。
[0004]这在研究和生物处理中是常规做法，其中把与启动子可操作地连接的所需表达产物的核酸序列引入生产细胞系中，通常是以载体的形式。
[0005]在基因治疗领域，这对单基因病症或孟德尔病症特别有意义，这些病症是由患者的细胞中存在的缺陷基因引起的。将与启动子可操作地连接的缺陷基因的野生型等位基因的核酸序列引入患者的细胞中是一种有利的治疗选择，因为理论上它可以治愈病况，而传统药物只能解决症状。
[0006]在基因治疗中，控制已被引入细胞的外源核酸的表达对患者的健康和安全至关重要。表达产物的水平不仅需要在治疗窗口内，而且需要在所需组织内或所需组织的特定区域中表达。在治疗窗口之外(即更低或更高)的表达或在治疗区域之外的表达，甚至在所需组织内的特定区域之外的表达，可能没有治疗作用，甚至是有害的。
[0007]多巴胺转运体缺乏综合征是儿童帕金森症的一种类型，是通过引入替代基因进行基因治疗的候选者，因为它是由单一基因DAT1/SLC6A3的功能缺失突变引起的(Kurian等人，2009)。DAT1/SLC6A3编码突触前多巴胺转运体，它参与将神经元外的多巴胺转运到多巴胺能神经元中。多巴胺转运体利用跨质膜的钠梯度的驱动力将多巴胺、两个钠离子和一个氯离子转运到细胞中。因此，DAT1/SLC6A3在调节多巴胺信号传导的持续时间和强度方面发挥作用(Ng等人，2014)，其功能障碍与各种神经精神病症有关，例如注意力缺陷多动症(Kurian等人，2009)。
[0008]引入替代的DAT1/SLC6A3基因的一个特殊困难是，在非疾病状态下，DAT1/SLC6A3是在中脑特异性表达的，如图1A所示。为了最好地模拟DAT1/SLC6A3的原始表达，需要确保替代的DAT1/SLC6A3基因在中脑内表达(因为这是多巴胺能神经元的位置)，但也优选在大脑的其他部位表达较少。
[0009]因此，在其他CNS区域中，需要有驱动在中脑中表达的启动子，以及驱动在中脑多巴胺能神经元中特异性表达的启动子。
[0010]安格曼综合症(Angelman syndrome)也是通过引入替代基因进行基因治疗的候选者。安格曼综合征最常见是由单一基因UBE3A的突变或缺失引起的。UBE3A参与靶向蛋白的降解。在大多数神经元中，只有从母体那里继承的UBE3A基因拷贝是有活性的，母体UBE3A基
因的缺失导致了安格曼综合征。
[0011]引入替代UBE3A基因的一个特殊困难是，在非疾病状态下，UBE3A在大脑中广泛表达，如图1B所示。为了最好地模拟UBE3A基因的原始表达，替代的UBE3A基因优选在大脑中广泛表达。
[0012]因此，还需要驱动在大脑许多或所有区域中的表达的启动子(例如泛CNS)。
[0013]CNS的其他疾病是基因治疗的合适目标，在一些这样的疾病中，可能需要治疗性基因在特定的CNS组织中定向表达，而在其他疾病中，可能适合在CNS中进行更普遍的、非特异性的表达。
[0014]本专利技术的一个或多个方面旨在解决上述的一个或多个问题。

技术实现思路

[0015]在本专利技术的第一方面，提供了一种合成的中枢神经系统(CNS)特异性启动子，其包括根据SEQ ID NO:1
‑
8、21
‑
26中任一个的序列或其功能变体，或由根据SEQ ID NO:1
‑
8、21
‑
26中任一个的序列或其功能变体组成。
[0016]在一些实施方案中，合成的CNS特异性启动子包括与SEQ ID NO:1
‑
8、21
‑
26中的任一个具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列或由与SEQ ID NO:1
‑
8、21
‑
26中的任一个具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列组成。
[0017]因此，本专利技术提供了各种合成的CNS特异性启动子及其功能变体。通常优选的是，根据本专利技术的启动子是SEQ ID NO:1
‑
8、21
‑
26中任一个的变体，它保留参考启动子的至少25％、50％、75％、80％、85％、90％、95％或100％的活性。适当地，所述活性使用本文所述的实施例进行评估，但也可以使用其他方法。
[0018]在一些实施方案中，合成的CNS特异性启动子包括SYNP_CRE151(SEQ ID NO:12)和下列CRE中的至少一个：
[0019]‑
CRE0004_Lmx1b(SEQ ID NO:9)；
[0020]‑
CRE0003_Pitx3(SEQ ID NO:10)；
[0021]‑
CRE0005_faf1_截短体(SEQ ID NO:28)；
[0022]‑
CRE0006_Pitx2_截短体(SEQ ID NO:29)。
[0023]‑
CRE0007_Pitx2_截短体(SEQ ID NO:30)；和
[0024]‑
CRE0008_Pitx2_截短体(SEQ ID NO:31)。
[0025]在本专利技术的另一个方面，提供了一种CNS特异性顺式调节元件(CRE)，其包括根据SEQ ID NO:9
‑
11、28
‑
31中的任一个的序列或其任一个的功能变体，或由根据SEQ ID NO:9
‑
11、28
‑
31中的任一个的序列或其任一个的功能变体组成。在一些实施方案中，CNS特异性CRE包括与SEQ ID NO:9
‑
11、28
‑
31中的任一个具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。
[0026]通常优选的是，根据本专利技术的CNS特异性CRE是SEQ ID NO:9
‑
11、28
‑
31中任一个的变体，它保留参考CRE的至少25％、50％、75％、80％、85％、90％、95％或100％的活性。保留的活性可以通过比较在参考启动子控制下的合适报告基因与在同等条件下包含替代的CRE的相同启动子本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种合成的CNS特异性启动子，其包括根据SEQ ID NO:1
‑
8、21
‑
26中任一个的序列或其功能变体。2.根据权利要求1所述的合成的CNS特异性启动子，其包括与SEQ ID NO:1
‑
8、21
‑
26中的任一个具有至少60％、65％、70％、75％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。3.根据权利要求1或2中任一项所述的合成的CNS特异性启动子，其中所述合成的CNS特异性启动子的功能变体保留了参考启动子的至少25％、50％、75％、80％、85％、80％、95％或100％的活性。4.一种CNS特异性顺式调节元件(CRE)，其包括根据SEQ ID NO:9
‑
11、28
‑
31中任一个的序列或其功能变体。5.根据权利要求4所述的CNS特异性顺式调节元件(CRE)，其包括与SEQ ID NO:9
‑
11、28
‑
31中任一个具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。6.一种合成的CNS特异性顺式调节模块(CRM)，其包括根据权利要求4或5所述的CRE。7.一种合成的CNS特异性启动子，其包括根据权利要求4或5所述的CRE或根据权利要求6所述的CRM。8.一种分离的最小或近端启动子，其包括根据SEQ ID NO:12
‑
13中任一个的序列或其功能变体。9.根据权利要求8所述的分离的最小或近端启动子，其包括与SEQ ID NO:12
‑
13中的任一个具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。10.一种合成的CNS特异性启动子，其包括根据权利要求8或9所述的最小或近端启动子。11.根据权利要求1
‑
3中任一项所述的合成的CNS特异性启动子，其中所述合成的CNS特异性启动子包括SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:21或其功能变体，或由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:21或其功能变体组成，并且其中当通过脑室内注射(ICV)施用时，所述合成的CNS特异性启动子在大脑中具有广泛活性。12.根据权利要求11所述的合成的CNS特异性启动子，其中所述合成的CNS特异性启动子在大脑中的活性水平为Synapsin
‑
1(SEQ ID NO:14)的活性的至少100％、150％或200％。13.根据权利要求1
‑
3中任一项所述的合成的CNS特异性启动子，其中所述合成的CNS特异性启动子包括SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:26，或由SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:26组成，并且其中当通过静脉内注射(IV)施用时，所述合成的CNS特异性启动子在中脑中具有活性。14.根据权利要求13所述的合成的CNS特异性启动子，其中所述合成的CNS特异性启动子在多巴胺能神经元中具有活性。15.一种表达盒，其包括根据权利要求1、2、3、7、10、11、12、13或14中任一项所述的合成的CNS特异性启动子，所述合成的CNS特异性启动子与编码表达产物的核酸序列可操作地连接。16.一种载体，其包括根据权利要求1、2、3、7、10、11、12、13或14中任一项所述的合成的CNS特异性启动子或根据权利要求15所述的表达盒。
17.根据权利要求16所述的载体，其是病毒载体，例如AAV载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体或慢病毒载体。18.根据权利要求17所述的载体，...

【专利技术属性】
技术研发人员：托尼，
申请(专利权)人：阿斯克肋匹奥生物制药公司，
类型：发明
国别省市：