一种构建DGTM转基因斑马鱼作为载体表达人源DGTM蛋白的方法技术

本发明专利技术公开了一种构建DGTM转基因斑马鱼作为载体表达人源DGTM蛋白的方法。该方法主要是利用CRISPR

【技术实现步骤摘要】
一种构建DGTM转基因斑马鱼作为载体表达人源DGTM蛋白的方法


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种构建DGTM转基因斑马鱼作为载体表达人源DGTM蛋白的方法。

技术介绍

[0002]皮肤是人体最大的器官，它具有保护、感觉、分泌、排泄、呼吸等功能。它通过抵御外界微生物的入侵以及排泄体内废物起到维持机体内环境稳定的作用。健康皮肤的完整性在维持人体的生理动态平衡中起着至关重要的作用。当皮肤受到损伤后，糖尿病或压力性溃疡等许多原因可延迟伤口愈合，这使得皮肤最基本的保护屏障功能和表皮及其附属元件的功能发生丧失，进而发生内环境平衡紊乱和各种皮肤相关功能紊乱，给患者造成了严重的身心损害和经济负担。
[0003]皮肤的结构主要分为表皮和真皮两部分。表皮在真皮上方，为皮肤最外面的一层，表皮分为几个层，从靠近真皮往上分为基底层、棘层、颗粒层和角质层。创面愈合的本质是重建皮肤表皮基底层的角质形成细胞。这是因为，在表皮各类细胞当中，角质形成细胞数量占80%以上，且表皮基底层的角质形成细胞可以进行细胞增殖并向外层推移分化形成表皮的分层结构。角质本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种构建DGTM转基因斑马鱼作为载体表达人源DGTM蛋白的方法，其特征在于：所述方法利用CRISPR
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Cas9基因编辑技术，将人源的DGTM因子联合敲入到斑马鱼中，构建转基因斑马鱼，用斑马鱼作为载体表达人源DGTM蛋白。2.根据权利要求1所述的一种构建DGTM转基因斑马鱼作为载体表达人源DGTM蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）在斑马鱼基因组上选择高效的目标靶点；（2）设计和制备DGTM供体质粒；（3）sgRNA和Cas9 mRNA的制备；（4）将DGTM 供体质粒、sgRNA和Cas9 mRNA显微注射到斑马鱼受精卵；(5) PCR筛选获得DGTM转基因斑马鱼品系。3.根据权利要求1所述的一种构建DGTM转基因斑马鱼作为载体表达人源DGTM蛋白的方法，其特征在于：具体包括以下方法：（1）在斑马鱼基因组上选择高效的目标靶点：在斑马鱼染色体上的非蛋白编码区，根据靶点预测和靶点的特异性的确认，选5
’‑
ACAGCTATTCTTTACAGTGTAGG
‑3’
作为靶标序列，称为PAM1区；在靶标序列附近选取两边长度分别为134bp和156bp的序列作为同源性重组修复的同源臂，分别称为左臂5
’
arm和右臂3
’
arm；（2）设计和制备DGTM 供体质粒：DGTM供体质粒中包含所需的目的基因DNP63A，GRHL2，TFAP2A和MYC，基因之间通过不同的2A元件，即P2A，T2A和E2A连接在一起，整个片段的5
’
端带有一个CMV启动子，3
’
端带有一个Poly(A)信号；目的片段两端带有用于同源性重组修复的同源臂5
’
arm和右臂3
’
arm及用于目的片段从供体质粒上分离的PAM2区序列；通过无缝克隆技术制备获得DGTM供体质粒DGTM donor ；（3）sgRNA和Cas9 mRNA的制备：通过PCR扩增得到上游带有T7启动子的sgRNA的双链DNA，用试剂盒进行体外转录得到sgRNA；通过PCR扩增得到上游带有SP6启动子且两侧带有核定位序列的Cas9 DNA序列，用试剂盒进行体外转录得到Cas9 mRNA；（4）将DGTM 供体质粒DGTM donor、sgRNA和Cas9 mRNA显微注射到斑马鱼受精卵：按照DGTM donor 质粒300ng/μL；Cas9 mRNA 100ng/μL；sgRNA 50ng/μL的比例将其混合，显微注射到斑马鱼胚胎中；(5) PCR筛选获得DGTM转基因斑马鱼品系：将注射的斑马鱼胚胎养大至性成熟时，与野生型斑马鱼杂交，取其胚胎提取基因组作为模板，PCR扩增基因敲入位点，扩增的条带经测序验证正确性，筛选DGTM基因敲入成功的转基因斑马鱼。4.根据权利要求3所述的一种构建DGTM转基因斑马鱼作为载体表达人源DGTM蛋白的方法，其特征在于：步骤（1）中所述左臂5
’
arm和右臂3

【专利技术属性】
技术研发人员：翁祖铨，陈燕秋，何小镇，
申请(专利权)人：福州大学，
类型：发明
国别省市：