调节核酸序列制造技术

本发明专利技术涉及调节核酸序列，特别是NS特异性启动子、细胞特异性启动子、多细胞特异性启动子及其元件。本发明专利技术还涉及包含此类启动子的表达构建体、载体、病毒体、药物组合物和细胞，以及它们的使用方法。调节核酸序列对基因治疗应用特别有用。用特别有用。用特别有用。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】调节核酸序列


[0001]本专利技术涉及调节核酸序列，特别是神经系统特异性启动子、细胞特异性启动子、多细胞特异性启动子及其元件。本专利技术还涉及包含此类启动子的表达构建体、载体、病毒体、药物组合物和细胞，以及它们的使用方法。所述调节核酸序列对基因治疗应用特别有用。

技术介绍

[0002]提供以下讨论以帮助读者理解本公开，并不构成对现有技术的内容或相关性的任何承认。
[0003]在对体内基因调节的内部机制进行广泛研究后，研究重点最近转向了通过将外源核酸序列引入细胞来调节基因表达。
[0004]这在研究和生物工艺中是常规做法，其中将与启动子可操作地连接的所需表达产物的核酸序列引入生产细胞系中，通常是以载体的形式。
[0005]在基因治疗领域，这对遗传性病症如单基因病症(或孟德尔病症)特别有意义，这些病症是由患者的细胞中存在缺陷基因引起的。将与启动子可操作地连接的缺陷基因的野生型等位基因的核酸序列引入患者的细胞是一种有利的治疗选择，因为它可以治愈病况，而传统药物只能解决症状。
[0006]另外地或替代地，当缺陷基因具有对野生型等位基因产生拮抗作用的显性负突变时，将能够抑制缺陷基因的核酸引入患者的细胞可能是有益的。最后，将能够抵消或减轻缺陷基因的有害影响的核酸序列引入患者的细胞也是替代性或辅助性的治疗选择。
[0007]在基因治疗中，控制已被引入细胞的外源核酸的表达对患者的健康和安全是最重要的。表达产物的水平不仅需要在治疗窗口内，而且表达需要在所需的组织内，甚至在所需组织的特定区域内，以使治疗有效。另外地，表达可能需要限制在特定的细胞类型或多种细胞类型，以避免副作用。在治疗窗口(即较低或较高)以外的表达或在治疗区域以外的表达，甚至在特定细胞或细胞组合以外的表达，可能没有治疗作用，甚至是有害的。
[0008]亨廷顿氏病是由亨廷顿基因的两个遗传拷贝中的一个上的常染色体显性突变引起的。这种神经退行性疾病与逐渐恶化的运动功能障碍和由神经元死亡引起的认知能力损害有关。亨廷顿氏病没有治愈方法，治疗的目的是缓解症状。由于该病是由对体内存在的野生型亨廷顿等位基因有拮抗作用的常染色体显性突变引起的，因此通过引入野生型等位基因进行替代治疗不太可能特别有益。
[0009]亨廷顿氏病的一个治疗选择是引入一种核酸，这种核酸可以抑制有缺陷的亨廷顿基因进入患者的细胞。在非疾病状态下，亨廷顿蛋白在全身表达，并且在CNS中的表达非常高，在CNS中它存在于所有的神经元中，也存在于胶质细胞中(Schulte和Littleton，2011)。由于有缺陷的亨廷顿基因的常染色体显性突变导致的功能丧失和/或有缺陷的亨廷顿基因的功能获得，不仅会导致神经元死亡，还会导致胶质细胞功能障碍。为了支持这一点，除了神经元死亡外，在亨廷顿患者的大脑中还观察到反应性小胶质细胞和激活的星形胶质细胞和少突胶质细胞(Schulte和Littleton，2011)。因此，希望表达不仅能在所有神经元中，而
且能在一些或所有胶质细胞中抑制有缺陷的亨廷顿基因的核酸。
[0010]因此，需要驱动在神经系统(NS)，特别是CNS中，特别是在特定的细胞类型，如神经元以及神经元支持细胞，包括一些或所有胶质细胞、少突胶质细胞、中间神经元等中的表达的启动子。在神经系统(NS)中的表达包括在中枢神经系统(CNS)和/或周围神经系统(PNS)的细胞中的表达。在CNS中的表达包括在大脑和脊髓的细胞中的表达，并且包括神经元细胞以及非神经元细胞、中间神经元或神经元支持细胞。在PNS中的表达包括在周围神经系统的细胞中的表达，并且包括神经元细胞以及非神经元细胞、中间神经元或神经元支持细胞。
[0011]另一个治疗选择是将能够抵消或减轻有缺陷的亨廷顿基因的有害影响的核酸序列引入患者的细胞中。亨廷顿氏病与胆固醇代谢异常有关，尽管合成减少，但胆固醇在大脑中持续积累(Boussicault等人，2016)。由于血脑屏障对胆固醇不具渗透性，CNS的胆固醇稳态与身体的其他部分是分开的，因此可以单独靶向。在CNS中，星形胶质细胞合成胆固醇，神经元通过神经元特异性酶CYP46A1代谢胆固醇(Boussicault等人，2016)。另外地，胆固醇在少突胶质细胞中代谢，产生髓鞘碱性蛋白(MBP)。在亨廷顿氏病中，CYP46A1表达水平降低，CYP46A1酶水平显然不足以克服大脑中的胆固醇积累(Boussicault等人，2016)。为了支持这一点，发现在小鼠亨廷顿氏病模型中，通过泛启动子CMV或CAG表达CYP46A1可以调节大脑中的胆固醇代谢(Kacher等人，2019)。因此，在神经细胞中表达额外的CYP46A1和/或将CYP46A1(以及因此代谢胆固醇的能力)引入胶质细胞，能够调节大脑中的胆固醇代谢。
[0012]虽然CYP46A1在CNS中的表达似乎是亨廷顿氏病的一个有吸引力的治疗选择，但在人类的基因治疗环境中，优选通过微创的全身施用，如静脉内或动脉内(如颈动脉内)施用，将编码CYP46A1的核酸引入NS中。然而，由于CYP46A1在非NS细胞中的表达，与泛启动子可操作地连接的编码CYP46A1酶的核酸的全身施用可能对NS以外的胆固醇代谢具有不想要的副作用。
[0013]因此，需要NS特异性启动子驱动在神经元和一些或所有胶质细胞中的表达。
[0014]其他NS的疾病也是合适的基因治疗靶标。在一些这样的疾病中，可能需要在特定的NS细胞中定向表达治疗基因，而在其他疾病中，可能适合在NS，优选在CNS中进行更普遍的、非特异性的表达。
[0015]本专利技术的一个或多个方面旨在解决上述问题中的一个或多个。

技术实现思路

[0016]在本专利技术的第一方面，提供了一种合成的神经系统(NS)特异性启动子，其包括以下顺式调节元件(CRE)或其功能变体中的至少一个或由其组成：
[0017]‑
CRE0001_S100B(SEQ ID NO:22)或其功能变体；
[0018]‑
CRE0002_S100B(SEQ ID NO:24)或其功能变体；
[0019]‑
CRE0005_GFAP(SEQ ID NO:19)或其功能变体；
[0020]‑
CRE0007_GFAP(SEQ ID NO:20)或其功能变体；
[0021]‑
CRE0009_S100B(SEQ ID NO:23)或其功能变体；
[0022]‑
CRE0012_Arc(SEQ ID NO:21)或其功能变体；
[0023]‑
CRE0006_GFAP(SEQ ID NO:27)或其功能变体；
[0024]‑
CRE0008_GFAP(SEQ ID NO:28)或其功能变体；
[0025]‑
CRE0006_AQP4(SEQ ID NO:37)或其功能变体；和
[0026]‑
CRE0008_AQP4(SEQ ID NO:38)或其功能变体
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种合成的神经系统(NS)特异性启动子，其包括以下顺式调节元件(CRE)或其功能变体中的至少一个或由其组成：
‑
CRE0001_S100B(SEQ ID NO:22)或其功能变体；
‑
CRE0002_S100B(SEQ ID NO:24)或其功能变体；
‑
CRE0005_GFAP(SEQ ID NO:19)或其功能变体；
‑
CRE0007_GFAP(SEQ ID NO:20)或其功能变体；
‑
CRE0009_S100B(SEQ ID NO:23)或其功能变体；
‑
CRE0012_Arc(SEQ ID NO:21)或其功能变体；
‑
CRE0006_GFAP(SEQ ID NO:27)或其功能变体；
‑
CRE0008_GFAP(SEQ ID NO:28)或其功能变体；
‑
CRE0006_AQP4(SEQ ID NO:37)或其功能变体；和
‑
CRE0008_AQP4(SEQ ID NO:38)或其功能变体可操作地连接至选自以下的启动子元件：
‑
CRE0003_CEND1_mp(SEQ ID NO:25)或其功能变体；
‑
CRE0009_SYN1_mp(SEQ ID NO:26)或其功能变体；
‑
CRE0001_CEND1_mp(SEQ ID NO:29)或其功能变体；
‑
CRE0002_CEND1_mp(SEQ ID NO:30)或其功能变体；
‑
CRE0008_SYN1_mp(SEQ ID NO:31)或其功能变体；
‑
CRE0013_SYN1_mp(SEQ ID NO:32)或其功能变体。
‑
CRE0015_GAP43_mp(SEQ ID NO:39)或其功能变体；
‑
CRE0016_Eno2_mp(SEQ ID NO:40)或其功能变体；和/或
‑
CRE0004_GFAP_mp(SEQ ID NO:41)或其功能变体。2.根据权利要求1所述的合成的NS特异性启动子，其包括以下顺式调节元件(CRE)或其功能变体中的至少一个或由其组成：
‑
CRE0001_S100B(SEQ ID NO:22)或其功能变体；
‑
CRE0007_GFAP(SEQ ID NO:20)或其功能变体；
‑
CRE0009_S100B(SEQ ID NO:23)或其功能变体；
‑
CRE0006_AQP4(SEQ ID NO:37)或其功能变体；和
‑
CRE0008_AQP4(SEQ ID NO:38)或其功能变体可操作地连接至选自以下的启动子元件：
‑
CRE0001_CEND1_mp(SEQ ID NO:29)或其功能变体；
‑
CRE0013_SYN1_mp(SEQ ID NO:32)或其功能变体；
‑
CRE0015_GAP43_mp(SEQ ID NO:39)或其功能变体；
‑
CRE0016_Eno2_mp(SEQ ID NO:40)或其功能变体；和/或
‑
CRE0004_GFAP_mp(SEQ ID NO:41)或其功能变体。3.根据权利要求1或2所述的合成的NS特异性启动子，其包括以下CRE或其功能变体中的至少一个或由其组成：
‑
CRE0001_S100B(SEQ ID NO:22)或其功能变体；
‑
CRE0007_GFAP(SEQ ID NO:20)或其功能变体；
‑
CRE0009_S100B(SEQ ID NO:23)或其功能变体；
‑
CRE0006_AQP4(SEQ ID NO:37)或其功能变体；和
‑
CRE0008_AQP4(SEQ ID NO:38)或其功能变体可操作地连接至选自以下的启动子元件：
‑
CRE0003_CEND1_mp(SEQ ID NO:25)或其功能变体；
‑
CRE0009_SYN1_mp(SEQ ID NO:26)或其功能变体；
‑
CRE0015_GAP43_mp(SEQ ID NO:39)或其功能变体；
‑
CRE0016_Eno2_mp(SEQ ID NO:40)或其功能变体；和/或
‑
CRE0004_GFAP_mp(SEQ ID NO:41)或其功能变体。4.根据权利要求3所述的合成的NS特异性启动子，其中所述功能变体包括与SEQ ID NO:20、22
‑
23、25
‑
26、37
‑
41中的任何一个具有至少60％、65％、70％、75％、80％、90％、95％、96％、...

【专利技术属性】
技术研发人员：安妮，
申请(专利权)人：阿斯克肋匹奥生物制药公司，
类型：发明
国别省市：