DNA扩增方法技术

本发明专利技术涉及在宿主细胞中扩增与CARE元件可操作地连接的DNA分子的方法。所述方法包括培养宿主细胞的步骤，所述宿主细胞包含与所述DNA分子可操作地连接的CARE元件、编码L4 22K多肽或其变体的核苷酸序列、包含编码AAV Rep多肽或其变体的核苷酸序列的核酸分子，以及任选的一种或多种另外的核酸分子。本发明专利技术还涉及与异源启动子可操作地连接的编码L4 22K多肽或其变体的核酸分子；编码与病毒基因可操作地连接的CARE元件的核酸分子；用于产生腺病毒载体和宿主细胞的方法；以及用于在宿主细胞中产生病毒颗粒，更优选AAV颗粒的方法。更优选AAV颗粒的方法。更优选AAV颗粒的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】DNA扩增方法


[0001]本专利技术涉及一种在宿主细胞中扩增与CARE元件可操作地连接的DNA分子的方法。该方法包括培养宿主细胞的步骤，所述宿主细胞包含与所述DNA分子可操作地连接的CARE元件、编码L4 22K多肽或其变体的核苷酸序列、包含编码AAV Rep多肽或其变体的核苷酸序列的核酸分子，以及任选的一种或多种另外的核酸分子。
[0002]本专利技术还涉及与异源启动子可操作地连接的编码L4 22K多肽或其变体的核酸分子；编码与病毒基因可操作地连接的CARE元件的核酸分子；用于产生腺病毒载体和宿主细胞的方法；以及用于在宿主细胞中产生病毒颗粒(更优选AAV颗粒)的方法。

技术介绍

[0003]腺相关病毒(AAV)是属于细小病毒科的单链DNA病毒。这种病毒能够感染广泛的宿主细胞，包括分裂细胞和非分裂细胞二者。此外，它是一种非致病性病毒，在大多数患者中仅产生有限的免疫反应。
[0004]在过去几年中，源自AAV的载体已成为一种非常有用且有前途的基因递送模式。这是由于这些载体的以下特性：
[0005]‑
AAV是小型无包膜病毒，并且它们只有两个天然基因(rep和cap)。因此，它们可以很容易地被操纵以开发用于不同基因治疗的载体。这是通过去除AAV基因组中的rep和cap基因并用可能为患者提供治疗益处的外源序列替换这些序列来实现的。
[0006]‑
AAV颗粒不易被剪切力、酶或溶剂降解。这有利于这些病毒载体的简单纯化和最终配制。
[0007]‑
AAV是非致病性的并且具有低免疫原性。这些载体的使用进一步降低了不良炎症反应的风险。与其他病毒载体(诸如慢病毒、疱疹病毒和腺病毒)不同，AAV是无害的并且被认为不会导致任何人类疾病。
[0008]‑
使用AAV载体可以将高达约4500bp的基因序列递送到患者中。
[0009]‑
虽然已显示野生型AAV载体有时会将遗传物质插入人类19号染色体，但通过从病毒基因组中去除rep和cap基因，大多数AAV基因治疗载体通常会消除此特性。在这种情况下，病毒在宿主细胞内保持游离形式。这些游离体在非分裂细胞中保持完整，而在分裂细胞中它们在细胞分裂过程中丢失。
[0010]天然AAV基因组包含两个基因，每个基因编码多个开放阅读框(ORF)：rep基因编码AAV生命周期和病毒基因组的位点特异性整合所需的非结构蛋白；cap基因编码结构衣壳蛋白。
[0011]此外，这两个基因的侧翼是由145个碱基组成的反向末端重复(ITR)序列，其能够形成发夹结构。这些发夹序列是第二条DNA链的不依赖引物酶的合成以及将病毒DNA整合到宿主细胞基因组中所必需的。
[0012]为了消除病毒的任何整合能力，重组AAV载体从病毒基因组的DNA中去除了rep和cap。为了产生这样的载体，将期望的转基因与驱动转基因转录的启动子一起插入反向末端
重复(ITR)之间；并且rep和cap基因反式提供。还提供了辅助基因，例如腺病毒E4、E2a和VA基因。rep、cap和辅助基因可以在转染到细胞中的另外的质粒上提供。
[0013]传统上，AAV载体的产生已经通过许多不同的途径实现。最初，AAV是使用野生型(WT)腺病毒血清型5产生的，同时用编码rep和cap基因以及AAV基因组的质粒转染细胞。这使得WT腺病毒能够提供许多促进病毒复制的反式因子。然而，这种方法存在许多限制：例如，每批AAV必须在制造后与Ad5颗粒分离，以提供纯产品，并且确保去除所有Ad5是具有挑战性的。此外，在生产过程中细胞将大量资源用于生产腺病毒颗粒而不是AAV的事实也是不合需要的。
[0014]在另一些系统中，已使用了表达rep和cap基因的稳定包装细胞系。在这样的系统中，rep和cap基因被整合到细胞基因组中，因此排除了对基于质粒的rep和cap基因的需要。然而，由于其固有的毒性，这些基因通常仅以低频率整合(例如每个细胞1
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2个拷贝)。这些系统需要用腺病毒载体感染。
[0015]最近，基于腺病毒的系统已被编码AAV生产所需的腺病毒基因组部分的质粒所取代。虽然这解决了一些关于最终病毒制剂中存在腺病毒颗粒的担忧，但仍然存在许多问题。这些问题包括需要预先制造足够的质粒以转染到生产细胞系中，以及转染本身固有的低效过程。这些系统的产量也低于使用基于Ad5的方法的产量。
[0016]最近，基于腺病毒的系统已被编码AAV生产所需的腺病毒基因组部分的质粒所取代。虽然这解决了一些关于最终病毒制剂中存在腺病毒颗粒的担忧，但仍然存在许多问题。这些包括需要预先制造足够的质粒以转染到生产细胞系中，以及转染本身固有的低效过程。这些系统的产量也低于使用基于Ad5的方法的产量。
[0017]先前已报道(Tessier,J.,等.J.Virol.2001；375
‑
383；Chadeuf,G.,等.J.Gene Med.2000；2:260
‑
268)利用AAV载体转染其中rep和cap基因已经在染色体上整合的Hela细胞系和腺病毒感染导致整合的rep
‑
cap序列扩增100倍。这些扩增的序列以染色体外形式存在。据说腺病毒DNA结合蛋白(DBP)对这种扩增至关重要。
[0018]这种现象在US2004/0014031中进一步描述，其中鉴定了顺式作用复制元件(CARE)。据说该CARE元件位于对应于AAV
‑
2基因组的核苷酸190
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361的171个核苷酸区域(实施例12)；这包括AAV p5启动子。据说该CARE元件受“CARE依赖性复制诱导物”(“CARE
‑
DRI”)的约束。据说这样的诱导物包括(全)腺病毒和疱疹病毒。更具体地，由腺病毒E2a基因编码的DNA结合蛋白(DBP)被鉴定为rep和cap基因的CARE依赖性扩增的特异性诱导物(US2004/0014031，实施例4)。
[0019]另外，在US2004/0014031中报道了CARE元件能够诱导相邻异源基因的扩增(实施例11)，即CARE元件能够充当复制起点。
[0020]现在已经发现，US2004/0014031中将“CARE依赖性复制诱导物(CARE
‑
DRI)”描述为对于CARE依赖性复制是必要和充分的是不正确的。在US2004/0014031中，该诱导物被描述为腺病毒DNA结合蛋白(DBP)，E2a表达盒的基因产物。已经发现，虽然DBP可能参与CARE依赖性复制，但它不足以介导该作用。从根本上需要腺病毒晚期基因之一的产物，即L4 22K。这种22K蛋白质以前只知道参与病毒衣壳化。
[0021]这种特异性诱导物及其精确作用机制的鉴定有助于产生扩增与CARE元件并列的基因的新方法，即通过提供L4 22K多肽。

技术实现思路

[0022]因此，本专利技术的一个目的是提供一种扩增与CARE元件并列的感兴趣基因的方法。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种在宿主细胞中扩增DNA分子的方法，其中所述DNA分子与CARE元件可操作地连接，所述方法包括在一定条件下培养宿主细胞的步骤，所述宿主细胞包含：(a)第一核酸分子，所述第一核酸分子包含与CARE元件可操作地连接的所述DNA分子；(b)第二核酸分子，所述第二核酸分子包含与编码L4 22K多肽或其变体的核苷酸序列可操作地关联的异源启动子；(c)第三核酸分子，所述第三核酸分子包含编码AAV Rep多肽或其变体的核苷酸序列；以及任选地另外，(d)一种或多种另外的核酸分子，所述另外的核酸分子包含与一种或多种腺病毒早期基因产物可操作地关联的一个或多个启动子，所述条件使得所述第二和第三以及任选地另外一种或多种另外的核酸分子表达，从而促进所述DNA分子的扩增。2.如权利要求1所述的方法，其中所述第一、第二、第三和另外的(当存在时)核酸分子独立地以以下方式存在于所述宿主细胞中：(i)在腺病毒载体中；(ii)稳定整合到所述宿主细胞基因组中；或(iii)在游离型载体或质粒中。3.如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述DNA分子编码治疗性多肽或病毒多肽。4.如权利要求3所述的方法，其中所述DNA分子编码rep基因序列和/或cap基因序列和/或包含侧翼AAV反向末端重复(ITR)或其片段的病毒转移载体。5.一种用于产生病毒颗粒的方法，所述方法包括以下步骤：(a)向宿主细胞中引入腺病毒载体，所述腺病毒载体包含：(i)包含与编码L4 22K多肽或其变体的核苷酸序列可操作地关联的异源启动子的核酸分子；(ii)包含转基因侧翼的5
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和3
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病毒ITR的转移质粒；(iii)用于包装病毒转移质粒的足够辅助基因，所述宿主细胞包含：CARE元件，其可操作地连接到(i)AAV cap基因；和(ii)包含编码病毒Rep多肽的核苷酸序列的核酸分子，优选地其中所述核苷酸序列未与功能性启动子可操作地关联，(b)在使得在所述宿主细胞内组装病毒颗粒的条件下培养所述宿主细胞；以及(c)从所述宿主细胞或从培养基中收获包装的病毒颗粒。6.一种用于产生病毒颗粒的方法，所述方法包括以下步骤：(a)向宿主细胞中引入腺病毒载体，所述腺病毒载体包含：(i)包含与编码L4 22K多肽或其变体的核苷酸序列可操作地关联的异源启动子的核酸分子；
(ii)包含编码病毒Rep多肽的核苷酸序列的核酸分子，优选地其中所述核苷酸序列未与功能性启动子可操作地关联，(iii)用于包装病毒转移质粒的足够辅助基因，所述宿主细胞包含稳定整合在所述宿主细胞基因组中的：(i)与AAV cap基因可操作地连接的CARE元件；和(ii)包含转基因侧翼的5
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和3
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病毒ITR的转移质粒，其中所述转移质粒可以与或可以未与所述CARE元件可操作地连接；(b)在使得在所述宿主细胞内组装病毒颗粒的条件下培养所述宿主细胞；以及(c)从所述宿主细胞或从培养基中收获包装的病毒颗粒。7.如权利要求5或权利要求6所述的方法，其中所述AAV cap基因整合在所述宿主细胞基因组中处于启动子的控制下，所述启动子由所述腺病毒载体内编码的多肽激活。8.如权利要求5
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7中任一项所述的方法，其中所述腺病毒载体包含阻遏型主要晚期启动子(MLP)，优选地其中所述MLP包含一个或多个能够调节或控制所述腺病毒晚期基因转录的阻遏元件，并且其中所述阻遏元件中的一个或多个插入在MLP TATA盒的下游。9.如权利要求5
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8中任一项所述的方法，其中所述编码病毒Rep多肽的核苷酸序列插入在E1/E3缺失的腺病毒载体的E1区。10.如权利要求5
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9中任一项所述的方法，其中包含编码病毒Rep多肽的核苷酸序列的所述核酸分子不包含功能性p5或功能性p19启动...

【专利技术属性】
技术研发人员：R，
申请(专利权)人：牛津大学创新有限公司，
类型：发明
国别省市：