狂犬病病毒重组丝状病毒或沙粒病毒假病毒及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及病毒基因工程技术领域，具体涉及狂犬病病毒重组丝状病毒或沙粒病毒假病毒及其制备方法和应用。本发明专利技术提供的重组狂犬病病毒载体为包含重组狂犬病病毒基因组DNA表达盒的哺乳动物表达质粒；所述表达盒包含重组狂犬病病毒基因组DNA和调控元件。由该重组狂犬病病毒载体拯救获得狂犬病病毒重组丝状病毒或沙粒病毒假病毒具有较高的拯救效率，制备的假病毒为复制增殖型假病毒，在体外培养过程中能够进行复制增殖并获得较高的病毒滴度，可作为沙粒病毒和丝状病毒野毒的替代物，用于检测沙粒病毒和丝状病毒的中和抗体及其效价，安全性较高且能够实现便捷的荧光可视化检测。性较高且能够实现便捷的荧光可视化检测。性较高且能够实现便捷的荧光可视化检测。

【技术实现步骤摘要】
狂犬病病毒重组丝状病毒或沙粒病毒假病毒及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及病毒基因工程
，具体涉及狂犬病病毒重组丝状病毒或沙粒病毒假病毒及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]拉沙热(Lassa fever,LF)是一种以出血热和多器官衰竭为特征的烈性、高致死率的人兽共患病，其病原是拉沙病毒(Lassa fever virus,LASV)，是沙粒病毒科，旧世界病毒属的成员之一。该病毒被列为生物安全四级病原体，在2001年4月《禁止生物武器公约》中被列入禁止使用的生物武器名录。LASV通过其天然宿主多乳鼠(Mastomys natalensis)的尿液或者粪便传播给人类。马尔堡病毒(Marburg virus，MARV)是一种有包膜的负链RNA病毒，是丝状病毒科、马尔堡病毒属成员之一。马尔堡出血热是一种由马尔堡病毒(Marburg virus，MARV)在人类和非人类灵长动物中引起致命的病毒性出血热，该疾病与埃博拉病毒病的临床症状十分相似。拉沙病毒和马尔堡病毒可通过直接或间接接触带毒动物尸体或分泌物发生感染，也可通过气溶胶进行传播。目前尚无获批可应用于临床的疫苗或药物。此外，拉沙热病毒和马尔堡病毒因其高传染性、高致死性均被列为生物安全四级病原体，是国际禁止的生物武器，同时也被WHO列为“预防传染病研发行动蓝图”计划中优先研究的病原体。
[0003]目前国际上拉沙病毒和马尔堡病毒的中和抗体检测方法多以实毒中和实验以及假病毒中和实验这两种检测方法为主，虽然拉沙病毒和马尔堡病毒实毒中和抗体检测方法对中和抗体效价评估准确性较高。但是，生物安全四级实验室资源以及拉沙病毒和马尔堡病毒实毒资源的匮乏已成为阻碍针对拉沙病毒和马尔堡病毒这类高危病原体预防性疫苗和治疗性抗体药物开发和有效性评价的主要因素之一。假病毒作为实毒的替代物，可较好的模拟拉沙病毒和马尔堡病毒入侵和感染特性，且在生物安全二级实验室(Biosafety Level 2 Laboratory,BSL
‑
2)即可操作，极大地降低了检测成本和病毒操作的生物安全风险。目前，研究者多用HIV和VSV载体包装的假病毒对中和抗体的中和能力进行评价，但是这两种包装载体多产生复制缺陷型假病毒，包装后所得病毒粒子无法进行体外扩增因此需要“现用现拯救”，且包装效率不稳定，拯救获得的假病毒滴度不高且一致性较差，当检测中和抗体的样本量过大时，假病毒量难以满足实验需求，大大增加了工作的繁琐程度和工作量。此外，HIV和VSV两种假病毒系统多使用萤火虫荧光素酶报告基因，在实际检测血清中和抗体效价时，需先裂解被假病毒感染的靶细胞，再使用荧光素酶底物作用，而后通过荧光检测仪测定相对光度值强度，进而判断待检样品在各稀释度下与假病毒的中和情况。这种中和抗体检测方法亦存在检测时间长、步骤繁琐、检测成本十分昂贵等弊端，不适用于样本的大规模检测。因此，开发新的假病毒体系对于拉沙病毒和马尔堡病毒的中和抗体检测以及推动拉沙病毒和马尔堡病毒诊断技术、预防性疫苗和治疗性抗体的研发具有重要意义。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是提供重组狂犬病病毒载体、狂犬病病毒重组丝状病毒或沙粒病毒假病毒及其制备方法和应用。
[0005]目前已有的丝状病毒或沙粒病毒假病毒多用于丝状病毒或沙粒病毒的疫苗开发，用于中和抗体检测的丝状病毒或沙粒病毒假病毒少有报道，且多为复制缺陷型假病毒。本专利技术以开发用于中和抗体检测的丝状病毒或沙粒病毒假病毒为目的，采用狂犬病病毒表达丝状病毒或沙粒病毒的囊膜糖蛋白。在研发过程中，本专利技术发现，狂犬病病毒自身的糖蛋白编码基因的存在会干扰丝状病毒或沙粒病毒中和抗体的检测，因此，采用丝状病毒或沙粒病毒的囊膜糖蛋白编码基因替换狂犬病病毒自身的糖蛋白编码基因，使得重组病毒表达丝状病毒或沙粒病毒的囊膜糖蛋白，但不表达狂犬病病毒自身的糖蛋白，以提高中和抗体检测的特异性和准确性。
[0006]具体地，本专利技术提供以下技术方案：
[0007]第一方面，本专利技术提供一种重组狂犬病病毒载体，所述载体为包含重组狂犬病病毒基因组DNA表达盒的哺乳动物表达质粒；
[0008]所述表达盒包含重组狂犬病病毒基因组DNA和调控元件；
[0009]所述重组狂犬病病毒基因组DNA为将狂犬病病毒基因组中的狂犬病病毒糖蛋白编码基因(G)替换为沙粒病毒或丝状病毒的囊膜糖蛋白编码基因(GP)得到；
[0010]或者，所述重组狂犬病病毒基因组DNA为将狂犬病病毒基因组中的狂犬病病毒糖蛋白编码基因替换为沙粒病毒或丝状病毒的囊膜糖蛋白编码基因，并在狂犬病病毒基因组中插入标记蛋白编码基因得到。
[0011]以上所述的替换是指将狂犬病病毒的糖蛋白编码基因的完整编码区替换为沙粒病毒或丝状病毒的囊膜糖蛋白编码基因。
[0012]本专利技术进一步发现，将狂犬病病毒自身的糖蛋白编码基因替换后，会导致重组病毒的拯救效率明显降低，且体外增殖培养的滴度也明显降低。为解决上述问题，本专利技术对重组病毒载体的调控元件进行了大量的优化，并发现采用CMV启动子和T7启动子顺次串联得到的双启动子启动重组狂犬病病毒基因组DNA的转录能够显著提高重组病毒的体外拯救效率及其病毒体外增殖培养的滴度。
[0013]以上所述的调控元件包括位于所述重组狂犬病病毒基因组DNA上游的CMV启动子和T7启动子。从5
’‑3’
端方向依次为CMV启动子和T7启动子。
[0014]在本专利技术的一些实施方式中，所述重组狂犬病病毒基因组DNA以CMV启动子和T7启动子启动转录。
[0015]在以上述双启动子启动重组狂犬病病毒基因组DNA转录的基础上，进一步结合核酶序列、终止子等调控元件的优化，进一步提高了重组病毒的体外拯救效率及其病毒体外增殖培养的滴度。
[0016]优选地，所述调控元件包括位于所述重组狂犬病病毒基因组DNA上游的顺次连接的CMV启动子、T7启动子和锤头型核酶序列以及位于所述重组狂犬病病毒基因组DNA下游的顺次连接的丁肝病毒核酶序列、T7终止子和poly(A)加尾信号序列元件。
[0017]锤头型核酶序列(HamRz)是从RNA病毒中分离得到的序列特异的核糖核酸酶，其复制依赖自我剪切，有利于保证转录出的重组狂犬病病毒基因具有精确的3
’
端。丁肝病毒核
酶序列(丁型肝炎病毒核酶序列，HDV)具有核酶活性，可进行分子内剪切(顺式剪切)，有利于保证转录出的重组狂犬病病毒基因具有精确的5
’
端，而转录产物具有精确的3
’
端和5
’
端是重组病毒拯救成功的必要条件。
[0018]以上所述的表达盒从5
’‑3’
方向依次为CMV启动子、T7启动子、锤头型核酶序列、重组狂犬病病毒基因组DNA、丁肝病毒核酶序列、T7终止子序列元件和poly(A)加尾信号序列元件。
[0019]其中，CMV启动子和T7启动子的序列分别如SEQ ID NO.1和2所示。
[0020]锤头型本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.重组狂犬病病毒载体，其特征在于，所述载体为包含重组狂犬病病毒基因组DNA表达盒的哺乳动物表达质粒；所述表达盒包含重组狂犬病病毒基因组DNA和调控元件；所述重组狂犬病病毒基因组DNA为将狂犬病病毒基因组中的狂犬病病毒糖蛋白编码基因替换为沙粒病毒或丝状病毒的囊膜糖蛋白编码基因得到；或者，所述重组狂犬病病毒基因组DNA为将狂犬病病毒基因组中的狂犬病病毒糖蛋白编码基因替换为沙粒病毒或丝状病毒的囊膜糖蛋白编码基因，并在狂犬病病毒基因组中插入标记蛋白编码基因得到。2.根据权利要求1所述的重组狂犬病病毒载体，其特征在于，所述调控元件包括位于所述重组狂犬病病毒基因组DNA上游的CMV启动子和T7启动子；优选地，所述调控元件包括位于所述重组狂犬病病毒基因组DNA上游的顺次连接的CMV启动子、T7启动子和锤头型核酶序列以及位于所述重组狂犬病病毒基因组DNA下游的顺次连接的丁肝病毒核酶序列、T7终止子和poly(A)加尾信号序列元件。3.根据权利要求1或2所述的重组狂犬病病毒载体，其特征在于，所述丝状病毒为马尔堡病毒，和/或，所述沙粒病毒为拉沙病毒；和/或，所述标记蛋白为荧光标记蛋白；优选地，所述标记蛋白编码基因插入在所述狂犬病病毒基因组的磷蛋白编码基因与基质蛋白编码基因之间。4.根据权利要求1或2所述的重组狂犬病病毒载体，其特征在于，所述狂犬病病毒为狂犬病病毒SRV9。5.狂犬病病毒重组丝状病毒或沙粒病毒假病毒，其特征在于，所述假病毒的基因组包含重组狂犬病病毒基因组DNA；所述重组狂犬病病毒基因组DNA为将狂犬病病毒基因组中的狂犬病病毒糖蛋白编码基因替换为沙粒病毒或丝状病毒的囊膜糖蛋白编码基因得到；或者，所述重组狂犬病病毒基因组DNA为将狂犬病病毒基因组中的狂犬病病毒糖蛋白编码基因替换为沙粒病毒或丝状病毒的囊膜糖蛋白编码基因，并在狂犬病病毒基因组中插入标记蛋白编码基因得到。6.根据权利要求5所述的狂犬病病毒重组丝状病毒或沙...

【专利技术属性】
技术研发人员：闫飞虎，毕津豪，赵永坤，冯娜，王铁成，高玉伟，杨松涛，夏咸柱，
申请(专利权)人：军事科学院军事医学研究院军事兽医研究所，
类型：发明
国别省市：