用于治疗CDKL5缺陷障碍的基因疗法制造技术

本披露提供了腺相关病毒载体、重组腺相关病毒(rAAV)、及其在用于治疗CDKL5缺陷障碍(CDD)的基因疗法中使用的方法。还提供了药物组合物，这些药物组合物包含本发明专利技术的rAAV和药学上可接受的载剂或赋形剂。这些药物组合物可用于治疗由CDKL突变引起的CDD的基因疗法中。用于治疗由CDKL突变引起的CDD的基因疗法中。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于治疗CDKL5缺陷障碍的基因疗法
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求于2020年2月14日提交的美国临时专利申请号62/976,483；以及于2020年10月12日提交的美国临时专利申请号63/090,492的权益和优先权，出于所有目的，其披露内容通过引用以其全文特此并入。
[0003]序列表
[0004]本申请包含序列表，该序列表已以ASCII格式电子提交，并通过引用以其全文特此并入。所述ASCII副本创建于2021年2月8日，名为ULP
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007WO_SL.txt，大小为80,765字节。


[0005]本披露总体上涉及重组腺相关病毒载体、重组腺相关病毒、及其在用于治疗CDKL5缺陷障碍的基因疗法中使用的方法。

技术介绍

[0006]CDKL5缺陷障碍(CDD)是由CDKL5基因突变引起的罕见神经发育性疾病，该神经发育性疾病可以表现为广泛的临床症状，严重程度差异较大。CDD的标志包括婴儿期发病难治性癫痫、发育延迟、智力残疾、视力损伤、语言缺乏、肌张力低下、运动功能障碍、睡眠紊乱、胃肠功能障碍和呼吸困难。虽然罕见，但据信发生率为40,000
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60,000名活产婴儿中大约1名，从而使其成为遗传性癫痫中最常见的形式之一。
[0007]CDKL5基因编码对正常大脑发育和功能必不可少的细胞周期蛋白依赖性激酶样5(CDKL5)蛋白。CDKL5蛋白参与大脑中神经元的形成、生长和迁移。其在大脑中广泛表达，主要存在于神经元和树突中，在细胞增殖、神经元迁移、轴突生长、树突状形态发生和突触发育中发挥作用。
[0008]CDD由CDKL5基因中的病原性变体引起，这些病原性变体包括缺失、截短、剪接变体和错义突变。参见Olson等人，2019，Pediatric Neurology[小儿神经病学]97：18
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25。这些变体可以减少功能性CDKL5蛋白的量和/或降低其在神经元中的活性。已发现超过150种CDKL5基因突变可引起CDD。参见Del Rosso等人，2017，The EuroBiotech Journal[欧洲生物技术杂志]1(2)：122
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127。
[0009]迄今为止，没有解决CDD(即CDKL5缺陷)的根本原因的治疗。目前，由于严重的运动和智力残疾，CDD患者通常需要24/7护理。此外，CDD患者经历的癫痫发作通常无法用现有的抗癫痫药物得到良好控制。因此，迫切需要解决疾病(功能性CDKL5缺陷)的根本原因的治疗方法。
[0010]本专利技术经由形成腺相关病毒载体来解决这一需要，这些载体介导编码功能性CDKL5的基因向患有CDD的患者的转移。本专利技术还描述了将编码功能性CDKL5的基因递送至患有CDD的患者的重组腺相关病毒(rAAV)的形成。

技术实现思路

[0011]本专利技术提供了组合物及其用于基因疗法的方法。更特别地，本文提供了重组腺相关病毒(rAAV)，其包含腺相关病毒(AAV)衣壳和包装在其中的用于治疗CDD的载体基因组。
[0012]在一方面，本披露提供了重组腺相关病毒(rAAV)，其包含AAV衣壳、和包装在其中的载体基因组，其中所述载体基因组包含：(a)启动子序列和(b)CDKL5或其同种型、或其功能性片段或功能性变体的部分或完全编码序列。
[0013]在另一方面，本披露提供了重组腺相关病毒(rAAV)，其包含AAV衣壳、和包装在其中的载体基因组，其中所述载体基因组包含：(a)5
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末端反向重复序列(5
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ITR)序列；(b)启动子序列；(c)CDKL5或其同种型、或其功能性片段或功能性变体的部分或完全编码序列；和(d)3
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末端反向重复序列(3
’‑
ITR)序列。
[0014]在又另一方面，本披露提供了rAAV，其包含AAV衣壳、和包装在其中的载体基因组，其中所述载体基因组包含：(a)5
’‑
ITR序列；(b)启动子序列；(c)CDKL5或其同种型、或其功能性片段或功能性变体的部分或完全编码序列；(d)聚腺苷酸化信号序列；和(e)3
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ITR序列。
[0015]在又另一方面，本披露提供了rAAV，其包含AAV衣壳、和包装在其中的载体基因组，其中所述载体基因组包含：(a)5
’‑
ITR序列；(b)增强子序列；(c)启动子序列；(d)内含子序列；(e)CDKL5或其同种型、或其功能性片段或功能性变体的部分或完全编码序列；(f)聚腺苷酸化信号序列；和(g)3
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ITR序列。
[0016]在一个实施方案中，CDKL5的部分或完全编码序列是野生型编码序列。在替代实施方案中，CDKL5的部分或完全编码序列是密码子优化的编码序列。在一个示例性实施方案中，CDKL5的部分或完全编码序列经密码子优化以在人中表达。在一些实施方案中，CDKL5的部分或完全编码序列包含与选自SEQ ID NO：1
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8的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更多同一性的序列。
[0017]在一些实施方案中，本披露提供了rAAV，其包含AAV衣壳和包装在其中的载体基因组，其中所述载体基因组包含：(a)启动子序列和(b)CDKL5的编码序列，该编码序列包含与选自SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7和8的序列具有至少95％同一性的序列。
[0018]在一些实施方案中，CDKL5由SEQ ID NO：1所示的野生型编码序列编码。在另一个实施方案中，可以使用比如SEQ ID NO：2所示的编码序列等编码序列表达CDKL5的变体或替代性天然同种型。在某些实施方案中，CDKL5由密码子优化的编码序列编码。在一些实施方案中，CDKL5由与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示的野生型编码序列具有小于80％同一性的密码子优化的编码序列编码。在一些示例性实施方案中，CDKL5由选自SEQ ID NO：3
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8的密码子优化的编码序列编码。在一些实施方案中，CDKL5由与选自SEQ ID NO：3
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8的序列具有至少80％同一性的密码子优化的编码序列编码。在一些实施方案中，CDKL5由与选自SEQ ID NO：3
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8的序列具有至少90％同一性的密码子优化的编码序列编码。在一些实施方案中，CDKL5由与选自SEQ ID NO：3
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8的序列具有至少95％同一性的密码子优化的编码序列编码。在一些实施方案中，CDKL5的编码序列在3
’
末端处可以进一步包含终止密码子(TGA、TAA、或TAG)。在一些实施方案中，表达的CDKL5蛋白包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种重组腺相关病毒(rAAV)，其中所述rAAV包含AAV衣壳和包装在其中的载体基因组，其中所述载体基因组包含：(a)启动子序列；以及(b)CDKL5的编码序列，其中所述编码序列包含与选自SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7和8的序列具有至少95％同一性的序列。2.根据权利要求1所述的rAAV，其中该AAV衣壳来自血清型1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、rh10或hu37的AAV。3.根据权利要求2所述的rAAV，其中该AAV衣壳来自AAV9。4.根据权利要求2所述的rAAV，其中该AAV衣壳来自AAV8。5.根据权利要求1所述的rAAV，其中该AAV衣壳是AAV9变体衣壳。6.根据权利要求1
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5中任一项所述的rAAV，其中该启动子是神经元特异性启动子。7.根据权利要求6所述的rAAV，其中该神经元特异性启动子选自人突触蛋白1(SYN1)启动子、小鼠钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II(CaMKII)启动子、大鼠微管蛋白αI(Ta1)启动子、大鼠神经元特异性烯醇化酶(NSE)启动子、人神经元特异性烯醇化酶(ENO2)启动子、人血小板源性生长因子β链(PDGF)启动子、人BM88启动子、和神经元烟碱受体β2(CHRNB2)启动子。8.根据权利要求7所述的rAAV，其中该神经元特异性启动子是人SYN1启动子。9.根据权利要求8所述的rAAV，其中该人SYN1启动子具有包含SEQ ID NO：12的核酸序列。10.根据权利要求8所述的rAAV，其中该人SYN1启动子具有由SEQ ID NO：12组成的核酸序列。11.根据权利要求1
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5中任一项所述的rAAV，其中该启动子选自鸡β
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肌动蛋白(CBA)启动子、巨细胞病毒(CMV)即早期基因启动子、甲状腺素转运蛋白(TTR)启动子、甲状腺素结合球蛋白(TBG)启动子、和α
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1抗胰蛋白酶(A1AT)启动子。12.根据权利要求11所述的rAAV，其中该启动子是CBA启动子。13.根据权利要求12所述的rAAV，其中该CBA启动子具有包含SEQ ID NO：13的核酸序列。14.根据权利要求12所述的rAAV，其中该CBA启动子具有由SEQ ID NO：13组成的核酸序列。15.根据权利要求1
‑
5中任一项所述的rAAV，其中该启动子是CDKL5基因特异性内源性启动子。16.根据权利要求15所述的rAAV，其中该CDKL5基因特异性内源性启动子包含至少15个连续核苷酸的核苷酸序列，该核苷酸序列与SEQ ID NO：14的相等长度区域具有至少95％同一性。17.根据权利要求1
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16中任一项所述的rAAV，其中该载体基因组进一步包含5
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ITR序列。18.根据权利要求1
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17中任一项所述的rAAV，其中该载体基因组进一步包含3
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ITR序列。19.根据权利要求17
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18中任一项所述的rAAV，其中该5
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ITR序列和/或该3
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ITR序列来自AAV2。
20.根据权利要求19所述的rAAV，其中该5
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ITR序列和该3
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ITR序列包含SEQ ID NO：11或由其组成。21.根据权利要求17
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18中任一项所述的rAAV，其中该5
’‑
ITR序列和/或该3
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ITR序列来自非AAV2来源。22.根据权利要求1
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21中任一项所述的rAAV，其中该载体基因组进一步包含聚腺苷酸化信号序列。23.根据权利要求22所述的rAAV，其中该聚腺苷酸化信号序列选自SV40聚腺苷酸化信号序列、牛生长激素(BGH)聚腺苷酸化信号序列和兔β珠蛋白聚腺苷酸化信号序列。24.根据权利要求23所述的rAAV，其中该聚腺苷酸化信号序列是SV40聚腺苷酸化信号序列。25.根据权利要求24所述的rAAV，其中该SV40聚腺苷酸化信号序列包含SEQ ID NO：15或由其组成。26.根据权利要求1
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25中任一项所述的rAAV，其中该载体基因组进一步包含一个或多个增强子序列。27.根据权利要求26所述的rAAV，其中该增强子选自巨细胞病毒(CMV)即早期基因增强子、甲状腺素转运蛋白增强子(enTTR)、鸡β
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肌动蛋白(CBA)增强子、En34增强子、和载脂蛋白E(ApoE)增强子。28.根据权利要求27所述的rAAV，其中该增强子是CMV即早期基因增强子。2...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢里尔，
申请(专利权)人：阿尔特拉吉尼克斯制药公司，
类型：发明
国别省市：