用于治疗糖原贮积病的方法和组合物技术

本发明专利技术提供了多种新颖腺相关病毒(AAV)载体，用于治疗Ia型糖原贮积病(GSD

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于治疗糖原贮积病的方法和组合物
相关申请的交叉引用
[0001]本申请要求于2018年12月18日提交的美国临时专利申请号62/781,380的权益和优先权，其披露内容出于所有目的通过引用整体并入本文。序列表
[0002]本申请包含序列表，所述序列表已以ASCII格式电子提交，并通过引用整体并入本文。所述ASCII副本创建于2019年12月16日，名为DIM
‑
010WO_SL_ST25.txt，大小为42,290字节。


[0003]本申请总体上涉及用于治疗糖原贮积病例如Ia型糖原贮积病的病毒载体，更具体地涉及腺相关病毒载体。

技术介绍

[0004]Ia型糖原贮积病(也称为GSD
‑
Ia或肝糖原累积症(von Gierke disease))是一种由糖原在身体细胞中积聚引起的遗传性疾病。糖原在某些器官和组织中的积累，尤其是在肝脏、肾脏和小肠中的积累，会损害其正常运作的能力。GSD
‑
Ia通常出现在出生后的第一年，伴有由糖原积累引起的严重低血糖和肝肿大。受影响的个体表现出生长迟缓、青春期延迟、乳酸性酸血症、高脂血症、高尿酸血症，以及在成人中的高肝腺瘤发病率。参见Lei等人,1993,Science[科学]262:580
‑
3。
[0005]GSD
‑
Ia是一种罕见的孤儿遗传病，由活性葡萄糖
‑6‑
磷酸酶
‑
α(G6P酶
‑
α)缺陷引起，G6P酶
‑
α是一种参与维持葡萄糖稳态的关键酶。G6P酶
‑
α由G6PC基因编码，在糖原分解和糖异生的最后一步催化葡萄糖
‑6‑
磷酸(G6P)水解为葡萄糖和磷酸盐。迄今为止，已经鉴定了超过80种导致G6P酶
‑
α缺陷和GSD
‑
Ia相关发展的突变。参见Chou等人,2010,Nat Rev Endocrinol[自然评论内分泌]6(12):676
‑
88。
[0006]目前无法治愈GSD
‑
Ia，目前针对患者的护理标准是膳食补充。如果严格遵循，膳食策略通常可以促进正常生长和青春期发育，但膳食疗法并不能完全预防高脂血症、高尿酸血症、乳酸性酸血症和肝脏脂肪堆积的发生。参见Rake等人,2002,Eur J Pediatr[欧洲小儿外科杂志]161增刊1:S20
‑
34。
[0007]已经探索了使用携带G6P酶
‑
α的重组腺相关病毒(AAV)的基因治疗方法来管理GSD
‑
Ia。参见，例如，美国专利号9,644,216和美国专利公开号2017/0362670。然而，要将AAV载体用于人基因疗法，开发稳健、可靠且可扩展的载体生产方法至关重要。专利技术人已经发现，当从各种宿主细胞平台表达时，修饰G6PC基因的启动子/增强子区域以去除某些序列(本文描述为“Alu元件”)显著提高了rAAV产量和质量。

技术实现思路

[0008]本专利技术提供用于治疗糖原贮积病的方法和组合物。更具体地，本文提供了可用于
基因疗法应用以治疗GSD
‑
Ia的重组核酸分子、腺相关病毒(AAV)载体和重组腺相关病毒(rAAV)。
[0009]一方面，本申请涉及包含经修饰的G6PC启动子/增强子(GPE)序列的重组核酸分子，其中所述经修饰的GPE缺少与Alu元件至少80％相同的一个或多个序列。在一些实施方案中，Alu元件选自SEQ ID NO:6的连续核苷酸1079
‑
1272(Alu
‑
1)、1633
‑
1968(Alu
‑
2)和2140
‑
2495(Alu
‑
3)。在一些实施方案中，经修饰的GPE具有与SEQ ID NO:1的连续核苷酸146
‑
2123 80％(例如80％、85％、90％、95％或100％)相同的序列：或与SEQ ID NO:7、8、9、10、11或12 80％(，例如80％、85％、90％、95％或100％)相同的序列。
[0010]在另一方面，本申请涉及包含本文所述的经修饰的G6PC启动子/增强子(GPE)序列和G6P酶
‑
α编码序列的重组核酸分子，其中经修饰的GPE能够指导G6P酶
‑
α编码序列的表达。在一些实施方案中，G6P酶
‑
α编码序列包含与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4至少80％(例如80％、85％、90％、95％或100％)相同的序列。在一些实施方案中，重组核酸分子进一步包含聚腺苷酸化(聚A)信号序列，例如SV40聚A信号序列(SEQ ID NO:14)。在一些实施方案中，重组核酸分子进一步包含内含子(SEQ ID NO:13)。在一些实施方案中，重组核酸分子包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2。
[0011]在另一方面，本申请涉及包含本文所述的重组核酸分子的重组载体。在一些实施方案中，载体是腺相关病毒(AAV)载体，例如血清型1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12的AAV载体或rh10(即AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12或rh10)。在示例性实施方案中，AAV载体是AAV血清型8(AAV8)载体。进一步提供了包含本文披露的重组核酸分子或重组载体的宿主细胞。在具体的实施方案中，宿主细胞可以适合AAV的繁殖。
[0012]在另一方面，本申请涉及增加rAAV产量的方法，所述方法包括将本文所述的AAV载体递送至宿主细胞培养物并从细胞培养物中收获rAAV。在一些实施方案中，宿主细胞培养物是真核宿主细胞培养物。
[0013]本文还提供了包含本文披露的重组核酸分子或AAV载体的rAAV。在一些实施方案中，本申请涉及用于治疗GSD
‑
Ia的rAAV，以及包含AAV衣壳和包装在其中的AAV载体基因组的rAAV，所述AAV载体基因组包含AAV 5
’
反向末端重复序列(ITR)序列；本文披露的经修饰的GPE序列；编码葡萄糖
‑6‑
磷酸酶α(G6P酶
‑
α)或其活性片段或变体的编码序列；和AAV 3
’
ITR序列。在一些示例性实施方案中，AAV衣壳是AAV8衣壳。在一些实施方案中，载体基因组包括与SEQ ID NO:15相同的5
’
和3
’
ITR序列。在一些实施方案中，载体基因组包括经修饰的GPE，其包含SEQ ID NO:1的连续核苷酸146
‑
2123。在一些实施方案中，载体基因组进一步包含聚腺苷酸化(聚A)信号序列，例如，SV40聚A信号序列(SEQ本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种重组核酸分子，所述重组核酸分子包含经修饰的G6PC启动子/增强子(GPE)序列，其中所述经修饰的GPE缺少与Alu元件至少80％相同的一个或多个序列。2.根据权利要求1所述的重组核酸分子，其中所述Alu元件选自SEQ ID NO:6的连续核苷酸1079
‑
1272(Alu
‑
1)、1633
‑
1968(Alu
‑
2)和2140
‑
2495(Alu
‑
3)。3.根据权利要求1或2所述的重组核酸分子，其中所述经修饰的GPE具有与SEQ ID NO:1的连续核苷酸146
‑
2123 80％相同的序列，或与SEQ ID NO:7、8、9、10、11或12中的任何一个80％相同的序列。4.一种重组核酸分子，所述重组核酸分子包含经修饰的G6PC启动子/增强子(GPE)序列和G6P酶
‑
α编码序列，其中所述经修饰的GPE能够指导所述G6P酶
‑
α编码序列的表达。5.根据权利要求4所述的重组核酸分子，其中所述经修饰的GPE缺少一个或多个与选自SEQ ID NO:6的连续核苷酸1079
‑
1272(Alu
‑
1)、1633
‑
1968(Alu
‑
2)和2140
‑
2495(Alu
‑
3)的Alu元件至少80％相同的序列。6.根据权利要求4或5所述的重组核酸分子，其中所述经修饰的GPE具有与SEQ ID NO:1的连续核苷酸146
‑
2123 80％相同的序列，或与SEQ ID NO:7、8、9、10、11或12中的任何一个90％相同的序列。7.根据权利要求4
‑
6中任一项所述的重组核酸分子，其中所述G6P酶
‑
α编码序列包含与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4相同的序列。8.根据权利要求4
‑
7中任一项所述的重组核酸分子，其中所述重组核酸分子进一步包含聚腺苷酸化(聚A)信号序列。9.根据权利要求8所述的重组核酸分子，其中所述聚腺苷酸化信号序列是SV40聚A信号序列。10.根据权利要求4
‑
9中任一项所述的重组核酸分子，其中所述重组核酸分子进一步包含内含子。11.根据权利要求4
‑
10中任一项所述的重组核酸分子，其中所述重组核酸分子包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2。12.一种重组载体，所述重组载体包含根据权利要求4
‑
11中任一项所述的重组核酸分子。13.根据权利要求12所述的载体，其中所述载体是腺相关病毒(AAV)载体。14.根据权利要求13所述的载体，其中所述AAV载体是AAV血清型8(AAV8)载体。15.一种分离的宿主细胞，所述分离的宿主细胞包含根据权利要求1
‑
11中任一项所述的重组核酸分子。16.一种分离的宿主细胞，所述分离的宿主细胞包含根据权利要求12
‑
14中任一项所述的重组载体。17.一种增加rAAV产量的方法，所述方法包括将根据权利要求13或14所述的重组载体递送至真核宿主细胞培养物并从所述真核细胞培养物中收获所述rAAV。18.一种重组AAV(rAAV)，所述重组AAV包含根据权利要求4
‑
11中任一项所述的重组核酸分子。19.根据权利要求18所述的rAAV，其中所述rAAV是rAAV8。20.一种组合物，所述组合物包含根据权利要求18或19所述的rAAV、和药学上可接受的
...

【专利技术属性】
技术研发人员：克里斯托弗，
申请(专利权)人：阿尔特拉吉尼克斯制药公司，
类型：发明
国别省市：