工程化的生产细胞系及其制备和使用方法技术

本申请涉及重组腺相关病毒(rAAV)包装细胞系和/或生产细胞系，其已经被工程化以降低一种或多种基因和/或蛋白的表达和/或活性以增加rAAV滴度。本文还描述了产生工程化的细胞系的方法。系的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】工程化的生产细胞系及其制备和使用方法
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求于2019年4月12日提交的美国临时专利申请号62/833,548；于2019年4月26日提交的美国临时专利申请号62/839,207；以及于2020年2月21日提交的美国临时专利申请号62/979,483的权益和优先权，出于所有目的，其公开内容通过引用以其全文并入本文。
[0003]序列表
[0004]本申请包含序列表，该序列表已以ASCII格式电子提交，并通过引用以其全文特此并入。所述ASCII副本创建于2020年4月9日，名为ULP
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[0005]本申请总体上涉及工程化的生产细胞系和/或包装细胞系以及产生用于增加重组腺相关病毒(rAAV)滴度的工程化的生产细胞系和/或包装细胞系的方法。

技术介绍

[0006]基于rAAV的载体是用于人基因治疗的最有希望的载体之一。rAAV载体被考虑用于广泛多种基因治疗应用。具体地讲，rAAV载体可将治疗性基因递送至分裂和非分裂细胞，并且这些基因可持续较长时间而不整合到靶细胞的基因组中。尽管用于产生rAAV的系统在过去二十年中已经发展，但仍有几个问题有待解决。rAAV生产系统的一个限制是rAAV颗粒的低滴度产量。基于rAAV的基因产物在临床前阶段的药物开发需要大量rAAV载体用于在较大物种中的研究，以实现有助于预测人类剂量的完全毒理学和生物分布研究。此外，因为目前的rAAV生产系统导致低滴度产量，所以制造用于人体试验和商业应用的足够水平的rAAV是有挑战性的。研究人员已经探索了许多方法来产生足够高滴度的rAAV颗粒，但是仍然非常需要解决这个问题。特别地，需要能够以高滴度产率产生高质量rAAV的有效细胞系。通过本文所述的工程化细胞系产生高滴度rAAV加速了这种载体系统用于体内基因治疗用途的应用。

技术实现思路

[0007]本公开通过提供包含其中一种或多种基因和/或蛋白已被修饰的细胞的rAAV包装细胞系和/或生产细胞系解决了获得用于基因治疗应用的改善的rAAV滴度的需要。本文还描述了鉴定与rAAV的产生相关的一种或多种基因和/或蛋白的方法，以及产生工程化的rAAV包装细胞系和/或生产细胞系的方法。
[0008]本文描述了产生rAAV包装细胞系和/或生产细胞系的组合物和方法，所述rAAV包装细胞系和/或生产细胞系包含与对照亲本细胞相比可产生更高滴度的rAAV的细胞。更具体地，本文提供了rAAV包装细胞系和/或生产细胞系，其包含其中一种或多种基因和/或蛋白的表达被调节，导致与对照亲本细胞相比更高的rAAV滴度的细胞。在一个方面，本公开提供了rAAV包装细胞系和/或生产细胞系，其包含与对照亲本细胞相比一种或多种基因和/或
蛋白的表达降低的细胞。例如，与对照亲本细胞相比，ATP5EP2(ATP合酶F1亚基ε假基因2)、LINC00319(长基因间非蛋白编码RNA319)、CYP3A7(细胞色素P450家族3亚家族A成员7)、ABCA10(ATP结合盒亚家族A成员10)、NOG(Noggin)、RGMA(排斥性引导分子BMP共受体A)、SPANXN3(SPANX家族成员N3)、PGA5(胃蛋白酶原A5)、MYRIP(肌球蛋白VIIA和Rab相互作用蛋白)、KCNN2(钾钙激活通道亚家族N成员2)和/或NALCN
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AS1(NALCN反义RNA1)的表达降低。
[0009]在一些实施方案中，本公开提供了包含其中与对照亲本细胞相比，KCNN2、LINC00319、RGMA和SPANXN3的表达降低的细胞的rAAV包装细胞系和/或生产细胞系。
[0010]在某些实施方案中，本公开提供了rAAV包装细胞系和/或生产细胞系，其包含经工程化以与相应未修饰的亲本细胞相比降低由ATP5EP2、LINC00319、CYP3A7、ABCA10、NOG、RGMA、SPANXN3、PGA5、MYRIP、KCNN2和/或NALCN
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AS1表达的基因产物的表达和/或活性的细胞。在某些实施方案中，本公开提供了rAAV包装细胞系和/或生产细胞系，其与相应的亲本细胞系相比，表现出由ATP5EP2、LINC00319、CYP3A7、ABCA10、NOG、RGMA、SPANXN3、PGA5、MYRIP、KCNN2和NALCN
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AS1中的至少一种表达的多肽或多核糖核苷酸的表达和/或活性降低。
[0011]在一个方面，本公开提供了rAAV包装细胞系和/或生产细胞系，其中使用核酸酶、双链RNA(dsRNA)、小干扰RNA(siRNA)、小发夹RNA(shRNA)、微RNA(miRNA)或反义RNA寡核苷酸(ASO)降低一种或多种基因的表达。
[0012]在某些实施方案中，用包含选自序列SEQ ID NO：1
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11中任一个的核苷酸序列的siRNA降低一种或多种基因的表达。例如，在一些实施方案中，ATP5EP2的表达降低，并且siRNA在有义链中包含SEQ ID NO：1的核苷酸序列和在反义链中包含SEQ ID NO：32的核苷酸序列。在一些实施方案中，LINC00319的表达降低，并且siRNA在有义链中包含SEQ ID NO：2的核苷酸序列和在反义链中包含SEQ ID NO：33的核苷酸序列。在一些实施方案中，CYP3A7的表达降低，并且siRNA在有义链中包含SEQ ID NO：3的核苷酸序列和在反义链中包含SEQ ID NO：34的核苷酸序列。在一些实施方案中，NOG的表达降低，并且siRNA在有义链中包含SEQ ID NO：4的核苷酸序列和在反义链中包含SEQ ID NO：35的核苷酸序列。在一些实施方案中，SPANXN3的表达降低，并且siRNA在有义链中包含SEQ ID NO：5的核苷酸序列和在反义链中包含SEQ ID NO：36的核苷酸序列。在一些实施方案中，MYRIP的表达降低，并且siRNA在有义链中包含SEQ ID NO：6的核苷酸序列和在反义链中包含SEQ ID NO：37的核苷酸序列。在一些实施方案中，KCNN2的表达降低，并且siRNA在有义链中包含SEQ ID NO：7的核苷酸序列和在反义链中包含SEQ ID NO：38的核苷酸序列。在一些实施方案中，NALCN
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AS1的表达降低，并且siRNA在有义链中包含SEQ ID NO：8的核苷酸序列和在反义链中包含SEQ ID NO：39的核苷酸序列。在一些实施方案中，RGMA的表达降低，并且siRNA在有义链中包含SEQ ID NO：9的核苷酸序列和在反义链中包含SEQ ID NO：40的核苷酸序列。在一些实施方案中，PGA5的表达降低，并且siRNA在有义链中包含SEQ ID NO：10的序列和在反义链中包含SEQ ID NO：41的序列。在一些实施方案中，ABCA10的表达降低，并且siRNA在有义链中包含SEQ ID NO：11的序列和在反义链本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种重组腺相关病毒(rAAV)包装细胞系和/或生产细胞系，其包含其中与对照亲本细胞相比，ATP5EP2、LINC00319、CYP3A7、ABCA10、NOG、RGMA、SPANXN3、PGA5、MYRIP、KCNN2和/或NALCN
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AS1的表达降低的细胞。2.根据权利要求1所述的包装细胞系和/或生产细胞系，其包含其中与对照亲本细胞相比，KCNN2、LINC00319、RGMA和SPANXN3的表达降低的细胞。3.根据权利要求1或2所述的包装细胞系和/或生产细胞系，其中使用核酸酶、双链RNA(dsRNA)、小干扰RNA(siRNA)、小发夹RNA(shRNA)、微RNA(miRNA)或反义RNA寡核苷酸(ASO)使所述表达降低。4.根据权利要求1至3中任一项所述的包装细胞系和/或生产细胞系，其中用包含选自序列SEQ ID NO：1
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11中任一个的核苷酸序列的siRNA使所述表达降低。5.根据权利要求4所述的包装细胞系和/或生产细胞系，其中ATP5EP2的表达降低，并且所述siRNA在有义链中包含SEQ ID NO：1的核苷酸序列和在反义链中包含SEQ ID NO：32的核苷酸序列。6.根据权利要求4所述的包装细胞系和/或生产细胞系，其中LINC00319的表达降低，并且所述siRNA在有义链中包含SEQ ID NO：2的核苷酸序列和在反义链中包含SEQ ID NO：33的核苷酸序列。7.根据权利要求4所述的包装细胞系和/或生产细胞系，其中CYP3A7的表达降低，并且所述siRNA在有义链中包含SEQ ID NO：3的核苷酸序列和在反义链中包含SEQ ID NO：34的核苷酸序列。8.根据权利要求4所述的包装细胞系和/或生产细胞系，其中NOG的表达降低，并且所述siRNA在有义链中包含SEQ ID NO：4的核苷酸序列和在反义链中包含SEQ ID NO：35的核苷酸序列。9.根据权利要求4所述的包装细胞系和/或生产细胞系，其中SPANXN3的表达降低，并且所述siRNA在有义链中包含SEQ ID NO：5的核苷酸序列和在反义链中包含SEQ ID NO：36的核苷酸序列。10.根据权利要求4所述的包装细胞系和/或生产细胞系，其中MYRIP的表达降低，并且所述siRNA在有义链中包含SEQ ID NO：6的核苷酸序列和在反义链中包含SEQ ID NO：37的核苷酸序列。11.根据权利要求4所述的包装细胞系和/或生产细胞系，其中KCNN2的表达降低，并且所述siRNA在有义链中包含SEQ ID NO：7的核苷酸序列和在反义链中包含SEQ ID NO：38的核苷酸序列。12.根据权利要求4所述的包装细胞系和/或生产细胞系，其中NALCN
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AS1的表达降低，并且所述siRNA在有义链中包含SEQ ID NO：8的核苷酸序列和在反义链中包含SEQ ID NO：39的核苷酸序列。13.根据权利要求4所述的包装细胞系和/或生产细胞系，其中RGMA的表达降低，并且所述siRNA在有义链中包含SEQ ID NO：9的核苷酸序列和在反义链中包含SEQ ID NO：40的核苷酸序列。14.根据权利要求4所述的包装细胞系和/或生产细胞系，其中PGA5的表达降低，并且所述siRNA在有义链中包含SEQ ID NO：10的序列和在反义链中包含SEQ ID NO：41的序列。
15.根据权利要求4所述的包装细胞系和/或生产细胞系，其中ABCA10的表达降低，并且所述siRNA在有义链中包含SEQ ID NO：11的序列和在反义链中包含SEQ ID NO：42的序列。16.根据权利要求3所述的包装细胞系和/或生产细胞系，其中所述核酸酶选自由锌指核酸酶(ZFN)、大范围核酸酶、转录激活物样效应物核酸酶(TALEN)或成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)相关蛋白组成的组。17.根据权利要求1至16中任一项所述的包装细胞系和/或生产细胞系，其中用CRISPR基因组编辑使所述表达降低。18.根据权利要求17所述的包装细胞系和/或生产细胞系，其中用指导RNA对使所述表达降低，其中每个指导RNA：(a)包含选自SEQ ID NO：12
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15的核苷酸序列的序列，和/或(b)靶向选自SEQ ID NO：16
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31的任一核苷酸序列的靶DNA序列。19.根据权利要求18所述的包装细胞系和/或生产细胞系，其中所述gRNA对用于靶向KCNN2并且包含含有SEQ ID NO：12的序列的第一gRNA分子和含有SEQ ID NO：13的序列的第二gRNA分子。20.根据权利要求18所述的包装细胞系和/或生产细胞系，其中所述gRNA对用于靶向KCNN2并且包含含有SEQ ID NO：14的序列的第一gRNA分子和含有SEQ ID NO：15的序列的第二gRNA分子。21.根据权利要求19或20所述的包装细胞系和/或生产细胞系，其中每个gRNA分子是2
′
O
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甲基类似物，其在其5
′
和3
′
端的任一者或两者上的末端三个核苷酸中包含3
′
硫代磷酸酯核苷酸间键。22.根据权利要求1至21中任一项所述的包装细胞系和/或生产细胞系，其中与对照亲本细胞相比，所述基因表达消除。23.根据权利要求1至22中任一项所述的包装细胞系和/或生产细胞系，其中所述细胞系是人细胞系。24.根据权利要求23所述的包装细胞系和/或生产细胞系，其中所述人细胞系是HeLa细胞系或人胚肾(HEK)293细胞系。25.根据权利要求1至2...

【专利技术属性】
技术研发人员：奥布里，
申请(专利权)人：阿尔特拉吉尼克斯制药公司，
类型：发明
国别省市：