一种溶瘤病毒的纯化方法技术

本发明专利技术公开了一种溶瘤病毒的纯化方法，涉及病毒纯化技术领域。本发明专利技术采用微载体法培养后的细胞与溶瘤病毒液共培养，经细胞裂解，去除病毒外的核酸和蛋白质，纯化后的病毒可以保持较为完整的衣壳，从而保证了纯化产物具有较高的活力，也即具有较高的病毒滴度。该方法可以快速得到较高纯度的溶瘤病毒。本发明专利技术提供的纯化方法有助于促进溶瘤病毒更为广泛的临床治疗应用。治疗应用。治疗应用。

【技术实现步骤摘要】
一种溶瘤病毒的纯化方法


[0001]本专利技术涉及病毒纯化
，具体而言，涉及一种溶瘤病毒的纯化方法。

技术介绍

[0002]由于生活环境和生活方式的变化，以及人口的老龄化、生存压力的增大等客观因素的影响，导致我国恶性肿瘤的发病率不断上升，成为第一位致死疾病。根据国家癌症中心统计的最新癌症报告显示，2014年全国恶性肿瘤估计新发病例数380.4万例，平均每天超过1万人被确诊为癌症，每分钟有7个人被确诊为癌症。按发病例数排位，肺癌位居全国发病首位，每年发病约78.1万，其后依次为胃癌、结直肠癌、肝癌和乳腺癌。而肺癌和乳腺癌分别位居男女性发病的首位。
[0003]目前，肿瘤的治疗主要以手术、放疗、化疗及药物治疗为主。其中，手术无法完全清除肿瘤组织，而放疗及化疗存在对人体伤害大的副作用。而抗癌药物尤其是进口抗癌药物的价格居高不下，对于普通家庭的癌症患者经济负担巨大。综上，肿瘤的总体缓解率和生存率尚未得到根本性的突破。
[0004]近年来，溶瘤病毒(oncolytic virus，OV)治疗肿瘤的特殊机制和疗效引起了人们的普遍兴趣，成为临床医生和科学家关注的焦点。溶瘤病毒特指可以感染肿瘤细胞并致其死亡而对正常组织没有影响的非致病性病毒颗粒，它可通过在肿瘤细胞内大量复制增殖来溶破肿瘤细胞，也可通过产生继发性免疫反应杀伤肿瘤，而对正常细胞无破坏作用。溶瘤病毒中呼肠孤病毒(reovirus)比较特殊，野生型呼肠孤病毒即能发挥显著的溶瘤效应，这样能避免因为基因改造所带来的争议，使得它在溶瘤病毒的临床应用研究中一路领先。但是，如何快速得到纯度高、滴度高的病毒一直是制约呼肠孤病毒临床治疗的关键因素。
[0005]鉴于此，特提出本专利技术。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供一种溶瘤病毒的纯化方法以快速得到纯度高、滴度高的病毒，为临床的及时治疗提供方便。
[0007]本专利技术是这样实现的：
[0008]本专利技术提供了一种溶瘤病毒的纯化方法，其包括如下步骤：采用微载体法培养细胞，加入溶瘤病毒液培养后，将培养液进行细胞裂解处理，进行纯化。
[0009]专利技术人发现，采用微载体法培养后的细胞与溶瘤病毒原液共培养，经细胞裂解，去除核酸，纯化后可以快速得到较高活力的溶瘤病毒，溶瘤病毒保持较高的纯度。
[0010]专利技术人首次将微载体培养应用到溶瘤病毒扩增纯化方法中，经过微载体培养可以快速实现细胞的放大，且重现性好，劳动强度小，单位体积培养液的细胞产率高。
[0011]若采用细胞培养工厂，则需要较大的培养空间，且耗费的时间和人力较大。
[0012]在本专利技术应用较佳的实施方式中，上述纯化为层析纯化或超速离心纯化。层析纯化是采用Capto core 700纯化柱进行柱层析；超速离心纯化是采用氯化铯密度梯度超速离
心进行纯化。
[0013]专利技术人发现，经过柱层析后的产物可以去除大量的细胞碎片、核酸分子、培养基等杂质，柱层析有助于提升溶瘤病毒的纯度。此外柱层析可以保持溶瘤病毒的内衣壳蛋白和外壳蛋白的完整性，从而保证了纯化获得的溶瘤病毒具有较高的活力，也即具有较高的病毒滴度。
[0014]此外，也可以利用氯化铯密度梯度的介质进行超速离心实现溶瘤病毒的纯化。
[0015]层析纯化包括：将Capto core 700纯化柱连接至AKTA蛋白纯化系统上，使用乙醇和病毒稀释缓冲液进行柱平衡，上样层析。
[0016]优选地，收集出现第一个峰后的液体，待峰下降后并有平稳的趋势时停止收集。专利技术人发现：收集第一个峰后直至峰下降并趋于平稳趋势阶段的液体，制得的病毒纯度和滴度保持较高水平。
[0017]在本专利技术应用较佳的实施方式中，上述纯化的方法包括将细胞裂解处理后的病毒液进行浓缩，浓缩完成后去除病毒外的核酸和蛋白质。通过浓缩以提高产物的纯度。
[0018]在一种实施方式中，上述浓缩是采用切向流超滤系统进行浓缩。进行浓缩时的切向速度为20
‑
40mL/min，进液压力控制在2.5bar以内。可选的，设置浓缩时的切向速度为25
‑
40mL/min，进液压力控制在0.5
‑
2.5bar。浓缩至原体积的四十分之一至五十分之一。
[0019]在本专利技术应用较佳的实施方式中，上述去除核酸是指将核酸酶与浓缩后的病毒液进行孵育处理。通过核酸酶酶切，以去除病毒液中残留的核酸分子，以便于后续的层析柱或超速离心实现核酸与病毒的分离，进而提高制得的病毒液的纯度。
[0020]优选地，孵育是在0
‑
8℃下孵育6
‑
18h。
[0021]在本专利技术应用较佳的实施方式中，上述微载体法培养细胞包括如下步骤：
[0022]按照3.0
×
105‑
5.0
×
105个细胞/载体的细胞量将细胞添加至载体上，培养直至80％
‑
90％的细胞附着在载体表面，然后扩大培养。
[0023]微载体可以是液体微载体、大孔明胶微载体、聚苯乙烯微载体、PHEMA微载体、甲壳质微载体、聚氨酯泡沫微载体、藻酸盐凝胶微载体以及磁性微载体等，只要能满足细胞的贴附和悬浮培养均在本专利技术的保护范围之内。
[0024]微载体上特殊的几何设计和表面处理增强了液体混合和固定的效率，并可提供剪切力的保护以及在细胞培养期间进行营养物质的转移。
[0025]微载体的大小为每片5毫米
×
10毫米，孔径50
–
200μm，增大单位体积内表面积(S/F)对细胞的生长极为有利。
[0026]微载体培养细胞时，控制搅拌速率为4
‑
6rpm/分钟。
[0027]在一种可选的实施方式中，扩大培养的培养条件是37
‑
38℃，以5％
‑
6％的CO2摇床培养。
[0028]在本专利技术应用较佳的实施方式中，待70
‑
80％的细胞贴壁生长后，加入溶瘤病毒液进行培养。
[0029]在本专利技术应用较佳的实施方式中，上述溶瘤病毒液的感染复数(multiplicity of infection,MOI)为1
‑
5。
[0030]优选地，加入溶瘤病毒原液进行培养的时间为20
‑
40h。可选的，采用台盼蓝染色以确定细胞病变的数量，待细胞病变达到80％时候收集细胞悬液进行后续的裂解。
[0031]在本专利技术应用较佳的实施方式中，上述溶瘤病毒为呼肠孤病毒、单纯疱疹病毒、腺病毒、牛痘病毒或水疱性口炎病毒。
[0032]在本专利技术应用较佳的实施方式中，上述微载体法培养的细胞为L929细胞。
[0033]在本专利技术应用较佳的实施方式中，上述细胞裂解是通过反复冻融或与裂解缓冲液混合孵育实现的细胞裂解；
[0034]上述反复冻融是在30～40℃和
‑
80℃～
‑
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种溶瘤病毒的纯化方法，其特征在于，其包括如下步骤：采用微载体法培养细胞，加入溶瘤病毒液培养后，将培养液进行细胞裂解处理，进行纯化。2.根据权利要求1所述的溶瘤病毒的纯化方法，其特征在于，所述纯化为层析纯化或超速离心纯化；所述层析纯化是采用Capto core 700纯化柱进行柱层析；所述超速离心纯化是采用氯化铯密度梯度超速离心进行纯化；优选地，将Capto core 700纯化柱连接至AKTA蛋白纯化系统上，使用乙醇和病毒稀释缓冲液进行柱平衡，上样层析；优选地，收集出现第一个峰后的液体，待峰下降后并有平稳的趋势时停止收集。3.根据权利要求1或2所述的溶瘤病毒的纯化方法，其特征在于，所述纯化的方法包括将细胞裂解处理后的病毒液进行浓缩，浓缩完成后去除病毒外的核酸和蛋白质；优选地，进行浓缩是采用切向流超滤系统进行浓缩；优选地，进行浓缩时的切向速度为20
‑
40mL/min，进液压力控制在2.5bar以内；优选地，浓缩至原体积的四十分之一至五十分之一。4.根据权利要求3所述的溶瘤病毒的纯化方法，其特征在于，所述去除核酸是指将核酸酶与浓缩后的病毒液进行孵育处理；优选地，所述孵育是在0
‑
8℃下孵育6
‑
18h。5.根据权利要求1所述的溶瘤病毒的纯化方法，其特征在于，所述微载体法培养细胞包括如下步骤：按照3.0
×
105‑
5.0
×
105个细胞/载体的细胞量将所述细胞添加至载体上，...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵星，何志旭，汪显耀，龙世棋，
申请(专利权)人：贵州医科大学，
类型：发明
国别省市：