【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于动物模型，尤其是涉及采用斑马鱼构建动物模型，模拟时空特异性损伤静脉血管内皮后血栓形成过程的方法。
技术介绍
1、血栓疾病一般按照血管性质可分为动脉血栓栓塞性疾病、静脉血栓栓塞性疾病和微血管血栓栓塞性疾病。静脉血栓栓塞症(venous thromboembolism,vte)包括深静脉血栓(deep venous thrombosis,dvt)和肺动脉栓塞(pulmonary embolism,pe)，是同种疾病在不同阶段的表现。dvt是血液在深静脉内异常凝结引起的静脉回流障碍性疾病,常发生于下肢。血栓如果脱落可造成pe,dvt与pe是同种疾病在不同阶段的表现。静脉血栓(venousthrombosis，vt)的不良后果是pe和血栓后综合征(post thrombotic syndrome,pts)，它可以显著影响患者的生活质量，甚至导致患者死亡。pts是一种慢性疾病，其体征和症状包括腿部肿胀、皮肤变化、疼痛和慢性溃疡。抗凝剂的治疗主要是通过防止血栓延伸、肺动脉栓塞和vt的复发，从而显著改善了患者的急性期结局。几类抗凝剂药物的相继开发，明显改善了接受治疗的患者的生活质量，但它们的使用与显著的出血风险相关。vte起病比较隐匿、早期往往没有明显自觉症状，给临床诊断带来极大的困难，同时患者的公共意识缺乏(低于其他血管疾病，如：心肌梗死、脑卒中等)。研究表明vte作为一种全球性疾病，其发病率平均为75～269/10万例次。而且随年龄增长vte的发病率逐渐上升。在年龄大于70岁的人群中其发病率每年约为200～700/10万例次
2、因此，建立vt动物模型来复制人类dvt，并剖析导致血栓形成的复杂生理过程、以及细胞群体的各种参数是可行的。vt动物模型可以帮助研究者寻求疾病起因，深入探讨病理生理变化、从而为研发新型治疗方法以及预测病情的转归提供便捷的途径，有重要研究和应用价值。
3、既往为了探究血栓的形成机制，有多种其它血栓动物模型被建立。其中通过外科手段将小鼠与兔子的下腔静脉进行结扎，虽然可以引起血栓的形成，但存在操作繁琐、手术风险高导致动物死亡率增高以及动物模型难以重复等缺点。
4、另外采用花生四烯酸、苯肼等化学方法，如中国专利技术专利cn 102266313 a，(“苯肼诱发建立斑马鱼血栓模型的方法”，张勇等，华东地区第13届实验动物科学学术交流会，2014年)均有所披露，这些方案虽然能够在无创的情况下诱导血栓形成，但由于化学氧化应激的方法，使得血栓部位随机形成，无法准确控制血栓形成部位，遂无法实现准确定位观察血栓。
5、采用激光损伤血管也可引起血栓形成，例如北德克萨斯大学生物科学系的pudurjagadeeswaran等人引入斑马鱼作为动物模型来研究止血的遗传学，开发了一种全球激光器诱导血栓形成法(“laser-induced thrombosis in zebrafish”，methodsin cellbiology,vol 101)，在这些研究中，主要是使用脉冲氮激光来引起尾静脉或动脉病变，导致血管闭塞。譬如，采用来自photonics公司的激光装置，脉冲氮激光光源一个连接到尼康显微镜，另一个连接到共聚焦显微镜。在这两个装置中，氮激光需要通过香豆素染料泵进行照射。通过在载物台上放置一个滑动形镜子，并通过10x物镜触发激光来测试激光的精度。
6、然而这类方法依然存在一些问题，首先，氮气激光从激发点到损伤点的过程中会照射损伤沿途的组织细胞造成不必要的损伤，无法在空间上将激光聚焦到血管内皮定点进行损伤。其次，氮气激光需要先通过coumarin dye attenuatorplate(香豆素染料衰减板)进行照射损伤，香豆素染料本身没有荧光，香豆素和香豆素衍生物是紫外线可激发的蓝色荧光染料，其短发射波长在至-480nm范围内。因此该方法是基于化学染料的紫外光损伤法，紫外光对组织细胞损伤过大，穿透能力不足。另外，该方法需要在载物台上放置一个滑动形镜子并通过×10物镜触发激光来测试激光的精度，该过程中激光会损坏镜子并允许一小束光通过。准备流程及操作过程繁琐。最后，该方法使用的斑马鱼红细胞与血管内皮均无荧光标记，无法准确观察记录。
7、此外常用的激光损伤血管引起血栓形成的方法所选用的激光波长常为紫外光波段，激光在穿透表皮损伤血管的过程中会对途经的皮肤和肌肉造成额外的烧灼损伤，最终无法更接近地模拟人体静脉血管内皮受损形成血栓斑块的过程，从而影响进行后续实验的针对性与准确性。
技术实现思路
1、为了解决上述问题，本专利技术提供了一种斑马鱼血栓动物模型的构建方法和用途，能够在无创无菌情况下定点损伤血管内皮且不会对焦点以外区域造成额外损伤，还能实时活体观察血栓形成过程的血栓动物模型。
2、本专利技术的第一个方面，采取了一个新的构思去模拟静脉血管内皮受到损伤后血栓形成的这一过程，即：选用转基因系斑马鱼tg(flk1:egfp；gata1:dsred)作为对象，采用红外光定点损伤斑马鱼尾部静脉血管内皮，定时定点诱导血管内血栓斑块的形成。
3、进一步的，在构建血栓动物模型时，选用3dpf转基因系斑马鱼tg(flk1:egfp；gata1:dsred)幼鱼为对象，该品系斑马鱼胚胎经ptu处理后在3dpf可抑制机体黑色素的生成，进而实现对血管实时直观的观察。
4、本专利技术的第二个方面，在构建血栓动物模型时，选用双光子激光扫描荧光显微镜进行红外光定点损伤斑马鱼尾部静脉血管内皮，所选用红外激光波长为920nm，激光大小50％且定位于损伤部位持续刺激2-3秒，便能实现在血管受损无大出血的前提下，能观察到红细胞逐一粘附形成血栓并阻塞血管，并实时观察记录血栓形成过程。
5、本专利技术在构建血栓动物模型时，在2分钟内即可造模成功且重复性高。在短时间内可多次造模，在损伤静脉血管内皮过程中无外科创面形成且无外源性感染风险。
6、与现有技术相比，本专利技术的优点及有益效果如下：
7、1、本专利技术技术方案在损伤静脉血管内皮过程中无外科创面形成且无外源性感染风险。
8、2、本专利技术技术方案可定点损伤血管内皮细胞，且不会对焦点以外区域在三维空间造成额外损伤。
9、3、本专利技术技术方案所构建的静脉血栓动物模型重复性好，在短时间内可多次造模且能同时在活体中实时观察记录血栓形成过程。
10、4、本专利技术技术方案所选用红外光与传统紫外光相比，组织穿透能力更强。
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1.一种斑马鱼血栓动物模型的构建方法，其特征在于，包括：选用转基因系斑马鱼Tg(Flk1:eGFP；gata1:dsRed)作为对象，采用红外光定点损伤斑马鱼尾部静脉血管内皮，导致血管内血栓斑块的形成。
2.根据权利要求1所述的斑马鱼血栓动物模型的构建方法，其特征在于，选用3dpf转基因系斑马鱼Tg(Flk1:eGFP；gata1:dsRed)幼鱼为对象。
3.根据权利要求1所述的斑马鱼血栓动物模型的构建方法，其特征在于，选用双光子激光扫描荧光显微镜进行红外光定点损伤斑马鱼尾部静脉血管内皮。
4.根据权利要求1或2或3所述的斑马鱼血栓动物模型的构建方法，其特征在于，所选用红外激光波长为920nm，激光大小50％且定位于损伤部位持续刺激2-3秒。
5.根据权利要求4所述的斑马鱼血栓动物模型的构建方法，其特征在于，所选用红外激光波长为920nm，激光大小50％且定位于损伤部位持续刺激2秒。
6.权利要求5所述方法构建的的斑马鱼血栓动物模型在筛选治疗血栓疾病药物中的应用。
7.权利要求5所述方法构建的的斑马鱼血栓动
...【技术特征摘要】
1.一种斑马鱼血栓动物模型的构建方法，其特征在于，包括：选用转基因系斑马鱼tg(flk1:egfp；gata1:dsred)作为对象，采用红外光定点损伤斑马鱼尾部静脉血管内皮，导致血管内血栓斑块的形成。
2.根据权利要求1所述的斑马鱼血栓动物模型的构建方法，其特征在于，选用3dpf转基因系斑马鱼tg(flk1:egfp；gata1:dsred)幼鱼为对象。
3.根据权利要求1所述的斑马鱼血栓动物模型的构建方法，其特征在于，选用双光子激光扫描荧光显微镜进行红外光定点损伤斑马鱼尾部静脉血管内皮。<...
【专利技术属性】
技术研发人员：舒莉萍，李化，赵砚驰，莫大双，徐鹏飞，何志旭，安丽娟，
申请(专利权)人：贵州医科大学，
类型：发明
国别省市：
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