基因治疗制造技术

本发明专利技术提供了一种腺相关病毒（AAV）载体基因治疗，其包含血管内皮生长因子（VEGF）C转基因；和最小肾病蛋白启动子NPHS1或足细胞启动子NPHS2。该基因治疗载体可用于靶向肾小球内的足细胞，以治疗或预防肾脏疾病，例如糖尿病肾病。肾病。肾病。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】基因治疗


[0001]本专利技术涉及包含VEGFC转基因和肾脏特异性启动子的基因治疗载体，以及基因治疗载体在治疗或预防糖尿病肾病中的用途。

技术介绍

[0002]系统性内皮功能障碍是糖尿病血管损伤发展的起始步骤，与微量白蛋白尿(尿白蛋白分泌30
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300毫克/天)有关。广泛接受的是微量白蛋白尿指示肾小球的破坏，并且是早期糖尿病肾病(DKD)的最早临床可检测指标。DKD在高达45％的糖尿病患者中发展，糖尿病患者占发达国家终末期肾病患者的50％。
[0003]血管内皮生长因子(VEGF)C作为不同形式的肾功能障碍的潜在治疗剂而出现，包括：通过重塑血管和淋巴网络，防止小鼠模型中多囊性肾病的发展；防止由于增强的淋巴管生成而在单侧输尿管梗阻的模型中的肾间质纤维化；以及最近的，通过增加肾脏淋巴密度，防止肾脏纤维化、白蛋白尿和盐引起的高血压的升高的血压。
[0004]专利技术人最近表明，VEGFC在肾小球中具有有益效果并且可以防止DKD。淋巴血管并不紧密地支撑肾中的肾小球，而VEGFC由足细胞表达，并向培养中的人类肾小球内皮细胞(GEnC)发出信号以增加屏障性质。小鼠中VEGFC的足细胞特异性过表达(podVEGFC)防止1型糖尿病模型中的白蛋白尿的发展，并阻止GEnC开窗密度的降低。此外，在2型糖尿病模型中，重组(r)VEGFC拯救了肾小球白蛋白渗透性。有趣的是，当在体内使用糖萼特异性酶破坏GEnC糖萼时，肾小球白蛋白渗透性被rVEGFC显著地拯救(Onions等人,2018)。这些数据共同表明VEGFC通过维持GEnC表型来防止早期DKD。VEGFC，如其他VEGFs，具有约9分钟的血浆半衰期，因此VEGFC的治疗潜力依赖于其连续的局部表达。
[0005]VEGFC基因治疗已成功地用于人类。已经使用5型腺病毒(Adv5)设计了用于人类的VEGFC基因治疗的策略(US2014/0087002)。该基因治疗通过结旁注射递送到患者自身的腹壁或腹股沟区域的组织瓣的脂肪垫中(即，靶向递送)。然后将组织瓣通过外科手术植入到受影响的手臂的腋窝区域。已成功地通过I期临床试验，证明其在15名患者的人群中是安全且良好耐受的。然而，当全身递送时，该Adv5载体被快速失活，导致感染效率问题。
[0006]在人类中对于DKD驱动VEGFC基因表达仍然是一个令人兴奋的机会，但它需要对于肾脏和在肾脏内适当地靶向。本专利技术的目的是提供一种新的基因治疗载体，其能够有效地将VEGFC递送到肾小球中的特定细胞，从而提供用于治疗或预防DKD的治疗。

技术实现思路

[0007]本专利技术提供了腺相关病毒(AAV)载体基因治疗，其包括血管内皮生长因子(VEGF)C转基因和最小肾病蛋白启动子NPHS1或足细胞启动子NPHS2。该基因治疗载体可用于靶向肾脏的肾小球内的足细胞，以治疗或预防肾脏疾病，例如糖尿病肾病。在不受理论束缚的情况下，本专利技术人相信，足细胞为肾脏疾病中的基因治疗方案提供了高度可追溯的靶，并且通过
将VEGFC靶向到足细胞，可以保护和/或拯救肾小球血管的完整性。
[0008]合适的AAV载体血清型包括2/9、LK03和3B。
[0009]AAV2/9血清型已显示出对新生和成年小鼠肾脏的显著趋向性，定位到肾小球和小管(Luo等人，2011；Picconi等人，2014；Schievenbusch等人，2010)，与肾静脉注射结合的AAV2/9载体已显示出适合于肾靶向基因递送(Rocca等人，2014)。因此，AAV 2/9是用于本专利技术基因治疗的一个合适的载体。
[0010]合成的AAV衣壳(例如LK03)也可以是用于本专利技术的基因治疗的合适的载体。该载体已显示在体外和体内高效率转导人类原代肝细胞。然而，直到现在它未被用于肾脏靶向基因递送。令人惊讶的是，AAV
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LK03载体在体外人类足细胞中可以实现接近100％的高转导，并且可以用于在体外转导足细胞(参见WO 2020/148548)。
[0011]AAV
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LK03帽子序列由来自七种不同野生型血清型(AAV1、2、3B、4、6、8、9)的片段组成，尽管AAV
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3B表示97.7％的帽子基因序列和98.9％的氨基酸序列。也已知AAV
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3B的人类肝细胞趋向性，其是用于本专利技术基因治疗的另一合适的载体。迄今为止，其尚未用于肾脏靶向基因递送。
[0012]VEGFC是一种淋巴管生成生长因子，已知通过两个受体(即VEGFR
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3(Flt 4)和VEGFR
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2(Flk 4))发出信号。VEGFC是由前肽形式的细胞产生的，其在裂解成四聚体之前成为二聚物，该四聚体由包含VEGF同源结构域的两个N
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末端31kDa形式和两个含有BR3基序的富含半胱氨酸的C
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末端29kDA形式组成。四聚体形式由细胞分泌，然后被裂解成中间形式，该中间形式由一个含有21kDa VEGF同源结构域的31kDa形式、一个含有BR3基序的富含半胱氨酸的29kDa形式和一个21kDa VEGF同源结构域组成。然后移除N
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末端前肽以产生成熟VEGFC，其由通过非共价相互作用结合的两个21kDa VEGF同源结构域组成。VEGFC的蛋白水解处理的进一步细节描述请见例如Joukov等人,1997。
[0013]VEGFC转基因包含编码任何形式的VEGFC(例如前肽形式、四聚体形式、中间形式或完全加工的成熟VEGFC)的多核苷酸。如果需要，编码不同形式的VEGFC多肽的多核苷酸可以以任何组合使用。优选地，VEGFC转基因包含编码一种或多种具有VEGFC生物活性的多肽(即，能结合并激活VEGFR
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2和/或VEGFR
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3的多肽)的多核苷酸。更优选地，VEGFC转基因包含一种多核苷酸，其编码包含VEGFC同源结构域且具有VEGFC生物活性的多肽(即，可结合并激活VEGFR
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2和/或VEGRF
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3的多肽)。合适的VEGFC多核苷酸和多肽的进一步细节包括WO 2015/022447和US 2014/0087002中描述的那些。
[0014]转基因物种优选地与患者物种匹配。例如，当治疗人类患者时，通常使用人类转基因。转基因可以是天然存在的，例如野生型，或其可以是重组的。转基因通常被包括在基因治疗载体中作为cDNA序列。然而，VEGFC转基因可以是任何多核苷酸，例如单链或双链DNA或RNA，包括编码如上所述的任何VEGFC多肽的核酸序列。例如，VEGFC多核苷酸可以包含图2的VEGFC开放阅读框(ORF)序列。VEGFC多核苷酸可以包含与图2的VEGFC ORF序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的核酸序列，只要其编码的VEGFC多肽已经保留了其生物活性，特别是保留了结合和激活VEGFR
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种腺相关病毒（AAV）载体基因治疗，包括：血管内皮生长因子（VEGF）C转基因；和最小肾病蛋白启动子NPHS 1或足细胞启动子NPHS2。2.根据权利要求1所述的AAV载体基因治疗，其中AAV载体为AAV血清型2/9、LK03或3B。3. 根据权利要求1或2所述的AAV载体基因治疗，其中所述 VEGFC转基因包含编码VEGFC前肽或VEGFC的中间形式或VEGFC的成熟形式的多核苷酸。4.根据权利要求1至3中任一项所述的AAV载体基因治疗，其中AAV载体另外包含土拨鼠肝炎转录后调控元件（WPRE）。5.根据权利要求1至4中任一项所述的AAV载体基因治疗，其中VEGFC转基因是人和/或包括血凝素（HA）标签。6.根据权利要求1至5中任一项所述的AAV载体基因治疗，其中AAV载体另外包含启动子与VEGFC转基因之间的Kozak序列。7.根据权利要求1至6中任一项所述的AAV载体基因治疗，其中AAV载体另...

【专利技术属性】
技术研发人员：R，
申请(专利权)人：布里斯托尔大学，
类型：发明
国别省市：