一种细菌基因定点转座与突变文库构建的方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种细菌基因定点转座与突变文库构建的方法及其应用。所述基因转座系统含有：(1)包含有编码Cas12k蛋白、TnsB蛋白、TnsC蛋白和TniQ蛋白的基因的表达构建体1；(2)包含与所述Cas12k蛋白相应的转座子序列、引导RNA骨架序列、及所述针对不同靶序列的靶向序列的表达构建体2。本发明专利技术能够对细菌基因组的至少一个位点进行转座，并能够进行细菌突变文库的构建，并用于筛选细菌中与不同环境压力相关的基因。关的基因。

【技术实现步骤摘要】
一种细菌基因定点转座与突变文库构建的方法及其应用


[0001]本专利技术涉及一种在细菌基因组上进行定点转座的基因组编辑方法及该方法在细菌基因组编辑以及细菌位点特异性突变文库构建与筛选中的应用。

技术介绍

[0002]细菌基因组具有丰富的序列多样性，这使得细菌能够快速适应环境的不断变化。人类从细菌基因组中获得了大量有用的资源，例如抗生素、各种生物酶、细菌发酵等。同时，研究人类致病菌中的各种致病基因与耐药基因，对于开发新型治疗药物与手段对抗细菌感染具有重要意义。但是由于细菌基因组的复杂性和多样性，到目前为止，自然界中只有少量细菌基因的功能得到了研究。基因组编辑和基因筛选技术是研究细菌基因功能的一个重要手段，对于推动人类对细菌的了解具有重要意义。为了探索细菌基因组中大量未开发的基因组功能，高通量基因组工程技术和筛选技术是分析细菌复杂基因网络的不可或缺的方法。
[0003]目前，已经有几种在细菌中进行高通量文库构建与筛选的技术，包括Tn
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seq、MAGE、TRMR和CREATE等。但是这几种技术各自存在缺点，例如Tn
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seq技术虽然能够通过在细菌基因组上进行基因转座从而构建细菌突变文库。但是该技术的转座是随机进行的，因此无法构建位点特异性的细菌突变文库，而且需要大量筛选才能得到目标突变体。而MAGE、TRMR和CREATE技术则依赖于细菌的同源重组效率，因此这几项技术的应用目前只局限于大肠杆菌中，而不能应用于其它同源重组能力较弱的细菌中。
[0004]2019年，一种CRISPR系统相关的转座系统—CAST系统被报道。这种系统包含V
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K型CRISPR蛋白—Cas12k以及与Tn7相似的转座酶TnsB、TnsC和TniQ，能够高效地在大肠杆菌中对特定位点进行基因转座。这种系统具有插入位点可控、易操作、效率高等特点，因此是一种理想的具有高通量突变文库构建应用潜力的技术，可以有效解决之前开发的技术所存在的缺陷。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是提供一种对细菌基因组进行基因转座的基因组编辑方法及其应用。本专利技术能够(1)高效并且快速地在不同的细菌菌株，包括但不限于铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌，对特定基因组位点进行基因转座；(2)结合高通量引物池合成技术和第二代测序技术，构建细菌针对特定基因位点的转座突变文库并进行数据分析。(3)对构建的细菌转座突变文库进行筛选，可以检测得到与细菌各种通路相关的基因。
[0006]为了达到上述目的，本专利技术的技术方案之一是一种能够对细菌的基因组进行转座的基因转座系统(或者双质粒系统)，所述基因转座系统含有：
[0007](1)包含有编码Cas12k蛋白、TnsB蛋白、TnsC蛋白和TniQ蛋白的基因的表达构建体1；
[0008](2)包含与所述Cas12k蛋白相应的转座子序列、引导RNA骨架序列、及针对不同靶
序列的靶向序列的表达构建体2。
[0009]简言之，其中一个质粒可以表达Cas12k、TnsB、TnsC和TniQ蛋白，另外一个质粒可以表达相应的引导RNA(gRNA)以及携带转座子序列。
[0010]优选地，所述的Cas12k、TnsB、TnsC和TniQ的序列分别如序列表中SEQ ID NO:1
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4所示。
[0011]优选地，相应的gRNA骨架以及转座子序列分别包含如序列表中的SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的序列。
[0012]优选地，在所述的引导RNA骨架序列的3
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末端添加针对所述靶序列的靶向序列，构成的完整引导RNA。其中，所述靶向序列为PAM序列之后的DNA片段，优选长度为23bp；所述PAM序列优选GTN，其中N为A、T、C和G中的任意碱基。
[0013]在本专利技术一优选实施方案中，所述表达构建体1包含如SEQ ID NO:7所示的序列，所述表达构建体2包含如SEQ ID NO:14所示的序列。
[0014]本专利技术的技术方案之二是一种基因定点转座/突变的方法，其包括将如上所述的基因组转座系统导入到含有靶序列的细菌内进行基因组转座编辑，并且可选地进行后续的筛选以及验证。
[0015]以上方法可用于，例如细菌基因组转座。
[0016]本专利技术中所述的“细菌”为自然界中所存在的各种细菌菌株，包括但不限于实施例中所述的铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯氏菌。
[0017]本专利技术的技术方案之三是一种利用如技术方案之二所述的方法得到的转座突变细菌。
[0018]本专利技术的技术方案之四是一种纯合的转座突变细菌的筛选方法，其包括将转座突变细菌通过抗生素和蔗糖筛选的方法进行纯化，得到完全转座突变的纯合细菌；所述转座突变细菌优选如技术方案之三所述的转座突变细菌。
[0019]本专利技术的技术方案之五为细菌突变文库的构建方法，所述构建方法可以自主选择特异性的基因和位点进行转座，从而能够根据需要选定细菌中某些特定基因进行突变，实现特定基因突变文库的构建。具体地，所述构建方法包括：
[0020](1)获取细菌基因组中的转录调控因子，基于其选择靶向序列；
[0021](2)根据不同的靶向序列构建不同的技术方案之一中所定义的表达构建体2；
[0022](3)将步骤(2)所得到的不同的表达构建体2和技术方案之一中所定义的表达构建体1转入细菌的感受态细胞中，得细菌基因突变文库。
[0023]本专利技术的技术方案之六是一种分析上述细菌突变文库的高通量测序和数据分析方法。
[0024]本专利技术的技术方案之七是一种上述细菌突变文库的筛选方法，能够在不同筛选条件下筛选相关抗性基因。
[0025]相比现有技术，本专利技术所述技术的有益之处在于能够有效地对细菌基因组特定位点进行转座，使特定基因失活或者引入特定的DNA序列，并能用于构建特定的细菌突变文库，因此在细菌生理研究、药物靶标发现、新型治疗药物开发方面具有广阔地应用前景。
[0026]在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本专利技术各较佳实例。
[0027]本专利技术所用试剂和原料均市售可得。
[0028]本专利技术的积极进步效果在于：
[0029]将Cas12k基因转座系统首次应用到铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌等细菌中，实现了高效的基因转座；开发了抗生素和蔗糖双重筛选的方法，用于获得纯合的转座突变单克隆菌落。首次将Cas12k基因转座系统应用于细菌突变文库构建，实现了细菌基因组特定位点的高通量突变。
附图说明
[0030]图1为pCASTPA和PGTPA的质粒结构和pCASTPA/PGTPA双质粒系统介导的铜绿假单胞菌中转座编辑的示意图。
[0031]图2为pCASTPA/PGTPA双质粒系统介导的PAO1菌株中rhlR基因位点转座的PCR验证图。
[0032]图3为经过庆大霉素和蔗糖筛选后，可以得到纯的转座细菌单克隆；结果显示，进行转座的铜绿假单胞菌本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种对细菌的基因组进行转座的基因转座系统，其含有：(1)包含有编码Cas12k蛋白、TnsB蛋白、TnsC蛋白和TniQ蛋白的基因的表达构建体1；(2)包含与所述Cas12k蛋白相应的转座子序列、引导RNA骨架序列、及针对不同靶序列的靶向序列的表达构建体2。2.如权利要求1所述的基因转座系统，其特征在于，所述转座子序列包含如SEQ ID NO:6所示的序列。3.如权利要求1所述的基因转座系统，其特征在于，所述的引导RNA骨架序列包含如SEQ ID NO:5所示的序列；和/或，在所述的引导RNA骨架序列的3
’
末端添加针对所述靶序列的靶向序列，构成的完整引导RNA。4.如权利要求3所述的基因转座系统，其特征在于，所述靶向序列为PAM序列之后的DNA片段，优选长度为23bp；所述PAM序列优选GTN，其中N为A、T、C和G中的任意碱基。5.如权利要求1所述的基因转座系统，其特征在于，编码所述Cas12k蛋白的核酸序列包含如SEQ ID NO:1所示的序列；和/或，编码所述TnsB蛋白的核酸序列包含如SEQ ID NO:2所示的序列；和/或，编码所述Tns...

【专利技术属性】
技术研发人员：季泉江，陈未中，
申请(专利权)人：上海科技大学，
类型：发明
国别省市：