腺相关病毒因子VIII载体制造技术

本发明专利技术提供了改进的腺相关病毒(AAV)因子VIII(FVIII)载体，包括产生功能性因子VIII多肽的AAV FVIII载体以及具有高表达活性的AAV FVIII载体。

【技术实现步骤摘要】
腺相关病毒因子VIII载体本申请要求2013年9月12日提交的美国临时专利申请序列号61/877,042的优先权，该美国临时专利申请以引用的方式整体并入本文。
本专利技术涉及腺相关病毒(AAV)因子VIII(FVIII)载体，包括具有高表达活性的AAVFVIII载体和表达全长或截短型功能性FVIII的AAVFVIII载体。本专利技术还涉及制备本文所述的AAVFVIII载体的方法和其相关的治疗用途。
技术介绍
腺相关病毒(AAV)是一种感染人类和一些其它灵长类物种的小的有复制缺陷的无包膜的动物病毒。AAV的若干特征使得这种病毒成为用于通过基因治疗递送治疗性蛋白质的有吸引力的运载体，包括例如已知AAV不会引起人类疾病并且AAV诱导轻微的免疫反应，以及AAV载体可以感染分裂的细胞和休眠细胞这两者而不整合到宿主细胞基因组中。使用AAV的基因治疗载体已经被成功地用于一些临床试验中，例如用于向肝脏递送人类因子IX(FIX)以治疗B型血友病(Nathwani等,NewEngl.J.Med.365:2357-2365,2011)。然而，AAV基因治疗载体确实有一些缺点。具体来说，AAV载体的克隆能力由于所述病毒的DNA包装能力而是有限的。野生型AAV的单链DNA基因组是约4.7个千碱基(kb)。实际上，最多约5.0kb的AAV基因组似乎被完全包装(即全长)到AAV病毒颗粒中。对于AAV载体中的核酸基因组必须具有两个具有约145个碱基的AAV反向末端重复序列(ITR)的要求来说，AAV载体的DNA包装能力使得蛋白质编码序列的最多约4.4kb可以被衣壳化。由于这一尺寸限制，大的治疗性基因，即长度大于约4.4kb的那些一般不适用于AAV载体中。一种这样的治疗性基因是因子VIII(FVIII)基因，它具有编码具有2332个氨基酸的多肽的约7.0kb的mRNA，所述多肽从N末端到C末端包含具有19个氨基酸的信号肽以及三个大的结构域(即重链或A结构域、中央或B结构域、以及轻链或C结构域)。已经被用于针对FVIII克服AAV载体尺寸限制的一种策略在于使用两种AAV载体，一种编码重链或A结构域，并且另一种编码轻链或C结构域(参见例如Coutu等的美国专利号6,221349、6,200,560以及7,351,577)。规避这一尺寸限制的另一种策略在于产生编码如下的FVIII的AAV载体，其中所述蛋白质的中央部分或B结构域已经缺失并且被具有14个氨基酸的接头置换，所述接头被称为SQ序列(Ward等,Blood,117:798-807,2011；以及McIntosh等,Blood121:3335-3344,2013)。虽然在文献中已经报道AAV载体具有>5.0kb的AAV基因组，但是在这些情况中的许多情况下，所编码的基因的5'末端或3'末端似乎被截短(参见Hirsch等,Molec.Ther.18-6-8,2010；以及Ghosh等,Biotech.Genet.Engin.Rev.24:165-178,2007)。然而，已经证实的是，在受AAV感染的细胞中在具有5'末端截短的核酸与具有3'末端截短的核酸之间存在重叠的同源重组，以使得产生编码大蛋白质的“完整”核酸，从而重新构建功能性的全长基因。对可用于基因治疗方法中以治疗A型血友病的编码功能性因子VIII蛋白质的新型AAV载体存在需要。因而，本专利技术涉及AAV载体，所述AAV载体编码功能活性FVIII以使得AAV病毒体将编码治疗性蛋白质的整个核酸衣壳化，即完全包装的AAVFVIII载体，从而避免尺寸过大的基因组的上述问题，或至少产生可能被截短或可能没有被截短的功能活性因子VIII蛋白质。此外，为了避免衣壳引导的免疫反应，AAV载体应当具有每个衣壳颗粒的靶蛋白的最高可能的转导/表达活性。本专利技术还涉及具有高表达活性的完全AAVFVIII载体的制备。最终，本专利技术涉及用于产生本文所述的AAV因子VIII载体的方法以及使用其的相关方法。
技术实现思路
本专利技术提供了编码功能活性FVIII的AAV载体(在本文被称为“AAVFVIII载体”)。编码功能活性FVIII的基因组优选地具有最多7.0kb的长度，更优选地具有最多6.5kb的长度，还更优选地具有最多6.0kb的长度，还更优选地具有最多5.5kb的长度，还更优选地具有最多5.0kb的长度，具有增强的启动子功能。如本文所用的“功能活性FVIII”是当在培养细胞中表达时具有野生型FVIII蛋白质的体外功能或当在细胞或身体组织中表达时具有野生型FVIII蛋白质的体内功能的FVIII蛋白质。这包括例如在患有A型血友病的受试者中允许发生凝血以及缩短血液凝固所耗费的时间。野生型FVIII经由凝血级联，充当激活的FIX(FIXa)的辅因子来参与凝血，所述激活的FIX在钙离子和磷脂存在下形成复合体，所述复合体将因子X(FX)转化成激活的FX(FXa)。因此，功能活性FVIII可以与FIXa形成复合体，所述复合体可以将FX转化成FXa。如本文所用的“AAV载体”指的是单链或双链的核酸，所述核酸具有：侧接蛋白质编码序列的AAV5'反向末端重复(ITR)序列和AAV3'ITR，所述蛋白质编码序列与转录调节元件，即一个或多个启动子和/或增强子、以及多聚腺苷酸化序列可操作地连接；以及任选的插入到所述蛋白质编码序列的外显子之间的一个或多个内含子。单链AAV载体指的是存在于AAV病毒颗粒的基因组中的核酸，并且所述核酸可以是本文所公开的核酸序列的正义链或反义链。这样的单链核酸的尺寸是以碱基提供的。双链AAV载体指的是存在于用于表达或转移AAV载体核酸的质粒(例如pUC19)的DNA或双链病毒(例如杆状病毒)的基因组中的核酸。这样的双链核酸的尺寸是以碱基对(bp)提供的。如本文所用的术语“反向末端重复序列(ITR)”指的是存在于AAV基因组的5'末端和3'末端处的本领域公认的区域，所述区域以顺式充当DNA复制起点和病毒基因组的包装信号。AAVITR连同AAVrep编码区一起提供在两个侧接的ITR之间插入到宿主细胞基因组中的核苷酸序列的高效切除和拯救以及整合。某些AAV相关ITR的序列由Yan等,J.Virol.79(1):364-379(2005)公开，该文献以引用的方式整体并入本文。“转录调节元件”指的是涉及调节基因转录的基因的核苷酸序列，包括启动子、加上响应元件、用于结合转录因子以有助于RNA聚合酶结合并且促进表达的激活子和增强子序列、以及与阻遏蛋白结合以阻断RNA聚合酶连接并且阻止表达的操纵子或沉默子序列。术语“肝脏特异性转录调节元件”指的是特异性地调节肝脏组织中的基因表达的调节元件。肝脏特异性调节元件的实例包括但不限于小鼠甲状腺素运载蛋白启动子(mTTR)、内源性人类因子VIII启动子(F8)、人类α-1-抗胰蛋白酶启动子(hAAT)和其活性片段、人白蛋白最小启动子、以及小鼠白蛋白启动子。还涵盖了源自于肝脏特异性转录因子结合位点的增强子，如EBP、DBP、HNF1、HNF3、HNF4、HNF6以及Enh1。在一个实施方案中，本发本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种腺相关病毒(AAV)因子VIII(FVIII)载体，所述载体包含核酸，所述核酸包含AAV2 5'反向末端重复序列(ITR)、肝脏特异性转录调节区、密码子优化的功能活性FVIII编码区、任选的一个或多个内含子、多聚腺苷酸化序列、以及AAV2 3'ITR。/n

【技术特征摘要】
20130912 US 61/877,0421.一种腺相关病毒(AAV)因子VIII(FVIII)载体，所述载体包含核酸，所述核酸包含AAV25'反向末端重复序列(ITR)、肝脏特异性转录调节区、密码子优化的功能活性FVIII编码区、任选的一个或多个内含子、多聚腺苷酸化序列、以及AAV23'ITR。


2.如权利要求1所述的AAVFVIII载体，其中所述核酸包含选自由以下各项组成的组的核苷酸序列：
i.SEQIDNO:1中所示的Proto1序列；
ii.SEQIDNO:2中所示的Proto1S序列；
iii.SEQIDNO:3中所示的Proto2S序列；
iv.SEQIDNO:4中所示的Proto3S序列；
v.SEQIDNO:5中所示的Proto4序列；
vi.SEQIDNO:6中所示的Proto5序列；
vii.SEQIDNO:7中所示的Proto6序列；
viii.SEQIDNO:8中所示的Proto7序列；
ix.SEQIDNO:9中所示的构建体100ATG序列；
x.SEQIDNO:10中所示的构建体100ATGbGH多聚腺苷酸序列；
xi.SEQIDNO:11中所示的构建体100ATG短bGH多聚腺苷酸序列；
xii.SEQIDNO:12中所示的构建体103ATG序列；
xiii.SEQIDNO:13中所示的构建体103ATG短bGH多聚腺苷酸序列；
xiv.SEQIDNO:14中所示的构建体105ATGbGH多聚腺苷酸序列；
xv.SEQIDNO:15中所示的构建体DC172ATGFVIII序列；
xvi.SEQIDNO:16中所示的构建体DC172ATGFVIIIhAAT序列；
xvii.SEQIDNO:17中所示的构建体DC1722×HCRATGFVIII序列；
xviii.SEQIDNO:18中所示的构建体DC1722×HCRATGFVIIIhAAT序列；
xix.SEQIDNO:19中所示的构建体2×丝氨酸蛋白酶抑制蛋白AhAATATGFVIII序列；
xx.SEQIDNO:20中所示的构建体2×丝氨酸蛋白酶抑制蛋白AhAATATGFVIII2×μ-球蛋白增强子序列；
xxi.SEQIDNO:21中所示的构建体100ATG短多聚腺苷酸2×μ-球蛋白增强子序列；
xxii.SEQIDNO:22中所示的构建体因子VIII-BMN001序列；
xxiii.SEQIDNO:23中所示的构建体因子VIII-BMN002序列；
xxiv.SEQIDNO:24中所示的构建体...

【专利技术属性】
技术研发人员：P·C·克罗希，A·纳斯瓦尼，J·麦金托什，E·塔德纳姆，
申请(专利权)人：生物马林药物股份有限公司，伦敦大学学院，
类型：发明
国别省市：美国;US