CD4阳性细胞特异性基因传递载体及其应用制造技术

本发明专利技术涉及分子药物学分子医学领域，特别是涉及CD4阳性细胞特异性基因传递载体及其应用。本发明专利技术提供了一种CD4阳性细胞特异性基因的传递载体，所述传递载体为在重组腺相关病毒(rAAV)的衣壳蛋白中插入一个七肽的重组腺相关病毒；所述七肽的氨基酸序列如SED ID NO：1～26中的任意一条所示。本发明专利技术通过在rAAV衣壳蛋白中插入一个七肽后，使得rAAV能够靶向高效递送转基因元件至CD4阳性细胞。所述传递载体能够选择性转导CD4阳性细胞，转基因表达水平明显高于野生型rAAV2载体，且能够进行有效的靶向基因编辑。

【技术实现步骤摘要】
CD4阳性细胞特异性基因传递载体及其应用
本专利技术涉及分子药物学分子医学领域，特别是涉及CD4阳性细胞特异性基因传递载体及其应用。
技术介绍
CD4+T细胞(即CD4阳性细胞)是一类具有重要作用的免疫细胞，在许多疾病的发生与发展中，发挥重要作用，如HIV感染/艾滋病、多种癌症、自身免疫性疾病和过敏性疾病。此外，CD4+T细胞通过与CD8+T细胞、B细胞和树突状细胞等不同免疫细胞相互作用，在免疫应答的协调方面发挥关键作用。因此，CD4+T细胞不仅是了解基础免疫学的重要靶细胞，而且也是基因治疗和免疫治疗的重要靶细胞。到目前为止，对CD4+T细胞的基因改造主要基于慢病毒载体(LVs)体外导入。然而，体外基因转移需要经过细胞的分离、长期扩增和再融合等操作，以上操作可能改变细胞的特性，降低其在体内的持久性，并导致不良反应。因此，非常有必要开发一种CD4+T细胞特异性基因传递载体，无论是局部还是全身给药的情况下，均可以起到将治疗基因递送到CD4+T细胞中。理想的基因载体需要具备几种特点：安全性高、不影响目的基因的表达、制备过程简单、价格低廉、能够长期稳定表达目的基因、具有靶向作用可将目的基因传递至靶细胞内、可调控目的基因在靶细胞内特异性表达等。因此，设计和开发安全、高效及靶向的基因载体是基因治疗领域的研究重点。在众多病毒载体中，腺相关病毒(AAV)由于高安全性及低免疫原性等优势，成为基因治疗最具前景的基因递送载体。重组腺相关病毒(recombinantAdeno-AssociatedVirus，rAAV)是人们利用DNA重组技术，对野生型AAV进行改造生产出来的可在人体内进行基因递送的载体。rAAV的衣壳由三种分子量大小不同的衣壳蛋白(VP)组成，每一个rAAV颗粒中含有5个VP1、5个VP2和50个VP3。VP1、VP2和VP3均由AAV病毒的同一个Cap基因编码而成，羧基端完全一致。但由于转录起点不同，VP1比VP2在氨基端多37个氨基酸，VP2比VP3在氨基端多65个氨基酸。衣壳蛋白的氨基酸组成决定了rAAV的宿主细胞类型。当rAAV进入人体后，通过AAV病毒衣壳与细胞表面受体的相互作用进入细胞内部，在转基因表达框内启动子及增强子的调控下实现目的基因的表达，从而达到基因治疗的目的。近年来，rAAV载体在许多人类疾病的基因治疗中占据了中心地位。截至目前为止，已有176个rAAV药物处于临床试验研究阶段，极具应用前景。尽管rAAV载体在基因治疗的临床应用上取得了成功，但作为CD4+T细胞的基因递送系统仍面临着重大挑战。天然血清型AAV可以转导多种细胞和组织，但对CD4+T细胞几乎不具有转导能力，必须进行适当改造。现有技术表明，将特异性靶向CD4阳性细胞的适体与siRNA结合，可以靶向转染CD4+T细胞，且有效敲低CD4+T细胞内相关基因的表达水平，在人源化小鼠体内有效防止HIV的感染。还有研究表明，直接将可靶向结合CD4阳性细胞的DARPin序列融合进AAV衣壳蛋白，所得到的AAV载体可以靶向递送至CD4+T细胞。但是，采用文献方法对rAAV载体进行表面靶向配体修饰，特异性靶向CD4阳性细胞的适体的修饰效率不理想，DARPin序列融合后会极大地降低rAAV载体的生产效率，很难作为可临床应用于CD4+T细胞的体内靶向基因递送载体。
技术实现思路
基于此，本专利技术提供了CD4阳性细胞特异性基因传递载体及其应用。本专利技术提供的具备靶向CD4+T细胞的新型rAAV载体，能够用于制备HIV感染导致的艾滋病、人类T淋巴细胞白血病病毒1型(HTLV-1)感染导致的成人T细胞白血病(ATL)等恶性疾病的基因治疗药物或基因编辑药物。为了实现上述目的，本专利技术提供了如下技术方案：本专利技术提供了一种CD4阳性细胞特异性基因的传递载体，所述传递载体为在重组腺相关病毒的衣壳蛋白中插入一个七肽的重组腺相关病毒；所述七肽的氨基酸序列如SEDIDNO：1～26中的任意一条所示。优选的，所述七肽的氨基酸序列如SEDIDNO：1或SEDIDNO：2所示。优选的，所述七肽的氨基酸序列插入的位置为重组腺相关病毒衣壳蛋白的第588和589氨基酸残基之间。本专利技术还提供了上述传递载体在制备基因治疗人类T淋巴细胞白血病病毒感染相关疾病的药物中的应用。本专利技术还提供了上述传递载体在制备基因编辑人类T淋巴细胞白血病病毒感染相关疾病的药物中的应用。优选的，所述人类T淋巴细胞白血病病毒感染相关疾病包括：HIV感染导致的艾滋病、人类T淋巴细胞白血病病毒1型感染导致的成人T细胞白血病。本专利技术提供了一种CD4阳性细胞特异性基因的传递载体，所述传递载体为在重组腺相关病毒的衣壳蛋白中插入一个七肽的重组腺相关病毒；所述七肽的氨基酸序列如SEDIDNO：1～26中的任意一条所示。本专利技术通过在rAAV衣壳中插入一个七肽后，使得rAAV能够靶向高效递送转基因元件至CD4阳性细胞。本专利技术提供的传递载体通过CD4阳性细胞为靶细胞进行转基因表达的验证可知，所述传递载体能够选择性转导CD4阳性细胞，转基因表达水平明显高于野生型AAV2载体，且能够进行有效的靶向基因编辑。由应用例可知，在衣壳中插入本专利技术提供的七肽的重组腺相关病毒(rAAV)对Jurkat细胞的转导效率显著高于野生型rAAV2，且编辑效率高于野生型rAAV2。附图说明图1为野生型AAV2基因组示意图及构建衣壳修饰文库质粒的引物设计位置；图2为在96个单菌落中的插入序列测序结果；图3为经3～5轮筛选后得到的靶向CD4细胞的插入序列；其中A为筛选前后插入序列的测序结果；B为经过第3，4，5轮筛选后，各插入序列富集度的饼状图，每一轮测定3个重复；图4为rAAV-NSV、rAAV-NDT和野生型rAAV2对Jurkat细胞的转导效率的比较，从左到右每列依次为野生型rAAV2、rAAV-NSV和rAAV-NDT；图5为rAAV-NSV、rAAV-NDT和野生型rAAV2对A549细胞的转导效率的比较，从左到右每列依次为野生型rAAV2、rAAV-NSV和rAAV-NDT；图6为rAAV-NSV、rAAV-NDT和野生型rAAV2载体介导的CD4阳性Jurkat细胞的基因编辑效率的比较结果，从左到右依次为rAAV-NSV、rAAV-NDT和野生型rAAV2。具体实施方式本专利技术提供了一种CD4阳性细胞特异性基因的传递载体，所述传递载体为在重组腺相关病毒的衣壳蛋白中插入一个七肽的重组腺相关病毒；所述七肽的氨基酸序列如SEDIDNO：1～26中的任意一条所示。本专利技术在rAAV衣壳蛋白的特定位置插入上述任一条七肽后，能够改变rAAV与宿主细胞结合的配体，得到的新型rAAV载体获得了与CD4阳性细胞特异性结合的能力，能够将所携带的转基因序列靶向递送CD4阳性细胞中。在本专利技术中，所述七肽的氨基酸序列优选如SEDIDNO：1或SEDIDNO：2所示。插入这两个七肽的新型rAAV载体，均可以高效转导CD4阳本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种CD4阳性细胞特异性基因的传递载体，所述传递载体为在重组腺相关病毒的衣壳蛋白中插入一个七肽的重组腺相关病毒；所述七肽的氨基酸序列如SED ID NO：1～26中的任意一条所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种CD4阳性细胞特异性基因的传递载体，所述传递载体为在重组腺相关病毒的衣壳蛋白中插入一个七肽的重组腺相关病毒；所述七肽的氨基酸序列如SEDIDNO：1～26中的任意一条所示。


2.根据权利要求1所述的传递载体，其特征在于，所述七肽的氨基酸序列如SEDIDNO：1或SEDIDNO：2所示。


3.根据权利要求1所述的传递载体，其特征在于，所述七肽的氨基酸序列插入的位置为重组腺相关病毒衣壳蛋白的第588和589氨...

【专利技术属性】
技术研发人员：刁勇，盛晓菁，
申请(专利权)人：华侨大学，
类型：发明
国别省市：福建;35