共表达分泌型IL-7和选择性CCL19的表达载体及其应用制造技术

本发明专利技术提供了共表达分泌型IL‑7和选择性CCL19的表达载体及其应用，所述表达载体包括IL‑6信号肽编码基因、IL‑7编码基因、NFAT调控型启动子和CCL19编码基因。本发明专利技术的表达载体中，在IL‑7编码基因的上游添加IL‑6信号肽的编码基因，实现了T细胞对IL‑7的分泌性表达；采用NFAT调控型启动子作为CCL19编码基因的启动子，实现了T细胞对CCL19的选择性表达，含有所述表达载体的CAR‑T细胞的增殖能力和肿瘤细胞杀伤效率均得到显著提高。

【技术实现步骤摘要】
共表达分泌型IL-7和选择性CCL19的表达载体及其应用
本专利技术属于生物医药
，涉及共表达分泌型IL-7和选择性CCL19的表达载体及其应用。
技术介绍
嵌合抗原受体T细胞(ChimericantigenreceptorTcell，CAR-T)免疫疗法是一种以嵌合型抗原受体为基础的细胞免疫治疗方法，通过体外基因转移技术，将编码嵌合抗原受体(CAR)的基因序列转导入T细胞中，生成可以结合靶抗原的肿瘤特异性T细胞。近年来，CAR-T疗法在治疗恶性血液肿瘤中取得令人瞩目的成果，美国FDA已经批准了两种靶向CD19的CAR-T细胞产品上市，国内也有多家公司针对CD19的靶点开展了临床试验。但是，CAR-T细胞治疗实体瘤效果不佳，主要原因是缺乏合适的靶抗原，CAR-T细胞在体内持续时间短，存在免疫逃逸、免疫抑制肿瘤微环境等问题。现有技术CN107109421A、CN109153989A将编码IL-7和CCL19的核酸序列由编码自切割肽的序列连接，构建的CAR-T细胞持续分泌IL-7和CCL19，不仅提高了CAR-T细胞的体外扩增能力，而且招募到更多的外周血循环T细胞和树突状细胞，增强了CAR-T细胞的抗肿瘤效果。但是，当CAR-T细胞留存在脾脏、淋巴结等免疫细胞较多的地方时，CCL19会将外周血循环T细胞和树突状细胞招募到特定部位，降低了T细胞和树突状细胞被招募到肿瘤内的几率，不能实现将外周血免疫细胞最大程度招募到肿瘤内部的效果。此外，IL-7蛋白分泌到胞外受到T细胞的严格控制，存在外源IL-7蛋白无法分泌到T细胞外的问题。因此，有必要对现有技术进行改进，使得CAR-T细胞不仅能将IL-7分泌到T细胞外，而且使CCL19最大程度将外周血免疫细胞招募到肿瘤内部，在肿瘤的治疗领域具有重要意义。
技术实现思路
针对现有技术的不足和实际需求，本专利技术提供了共表达分泌型IL-7和选择性CCL19的表达载体及其应用，含有所述表达载体的CAR-T细胞不仅能将IL-7分泌到T细胞外，而且使CCL19最大程度将外周血免疫细胞招募到肿瘤内部，进一步提高了CAR-T的肿瘤杀伤能力。为达此目的，本专利技术采用以下技术方案：第一方面，本专利技术提供了一种共表达分泌型IL-7和选择性CCL19的表达载体，所述表达载体包括IL-6信号肽编码基因、IL-7编码基因、NFAT调控型启动子和CCL19编码基因。本专利技术中，将IL-7信号肽替换为T细胞分泌蛋白IL-6的信号肽，在IL-7编码基因的上游添加IL-6信号肽的编码基因，实现了T细胞对IL-7的分泌性表达；采用NFAT调控型启动子作为CCL19编码基因的启动子，实现了T细胞对CCL19的选择性表达。优选地，所述IL-6信号肽编码基因包括SEQIDNO:1所示的核酸序列；SEQIDNO:1：atgaactccttctccacaagcgccttcggtccagttgccttctccctggggctgctcctggtgttgcctgctgccttccctgcccca。优选地，所述IL-7编码基因包括SEQIDNO:2所示的核酸序列；SEQIDNO:2：gattgtgatattgaaggtaaagatggcaaacaatatgagagtgttctaatggtcagcatcgatcaattattggacagcatgaaagaaattggtagcaattgcctgaataatgaatttaacttttttaaaagacatatctgtgatgctaataaggaaggtatgtttttattccgtgctgctcgcaagttgaggcaatttcttaaaatgaatagcactggtgattttgatctccacttattaaaagtttcagaaggcacaacaatactgttgaactgcactggccaggttaaaggaagaaaaccagctgccctgggtgaagcccaaccaacaaagagtttggaagaaaataaatctttaaaggaacagaaaaaactgaatgacttgtgtttcctaaagagactattacaagagataaaaacttgttggaataaaattttgatgggcactaaagaacac。优选地，所述NFAT调控型启动子包括SEQIDNO:3所示的核酸序列；SEQIDNO:3：ggaggaaaaactgtttcatacagaaggcgtggaggaaaaactgtttcatacagaaggcgtagatctagactctagagggtatataatggaagctcgaattccagcttggcattccggtactgttggtaaaaagcttggcaatccggtactgttggtaaagccacc。优选地，所述CCL19编码基因包括SEQIDNO:4所示的核酸序列；SEQIDNO:4：atggccctgctactggccctcagcctgctggttctctggacttccccagccccaactctgagtggcaccaatgatgctgaagactgctgcctgtctgtgacccagaaacccatccctgggtacatcgtgaggaacttccactaccttctcatcaaggatggctgcagggtgcctgctgtagtgttcaccacactgaggggccgccagctctgtgcacccccagaccagccctgggtagaacgcatcatccagagactgcagaggacctcagccaagatgaagcgccgcagcagt。优选地，所述表达载体包括病毒载体。优选地，所述病毒载体包括慢病毒载体、逆转录病毒载体或腺相关病毒载体中的任意一种，优选为慢病毒载体。第二方面，本专利技术提供了一种重组慢病毒，所述重组慢病毒采用第一方面所述的表达载体与包装辅助质粒共转染哺乳细胞制备得到。优选地，所述哺乳细胞包括293细胞、293T细胞或293F细胞中的任意一种或至少两种的组合。第三方面，本专利技术提供了一种嵌合抗原受体T细胞，所述嵌合抗原受体T细胞表达特异性结合肿瘤抗原的嵌合抗原受体、分泌型IL-7和选择性CCL19。优选地，所述嵌合抗原受体T细胞包括第一方面所述的表达载体和/或第二方面所述的重组慢病毒。本专利技术中，采用第一方面所述的表达载体和/或第二方面所述的重组慢病毒构建的CAR-T细胞可以将外源性IL-7分泌到T细胞外，充分发挥IL-7对T细胞的体外增殖能力的促进作用；同时在CAR-T细胞识别肿瘤抗原被激活的情况下才表达CCL19，保证CAR-T细胞在肿瘤内部时才表达分泌CCL19，显著提高了CAR-T的杀伤效率。优选地，所述嵌合抗原受体包括信号肽、抗原结合结构域、跨膜结构域和信号传导结构域。优选地，所述抗原结合结构域结合肿瘤表面抗原，所述肿瘤表面抗原包括CD19、CD20、CD22、CD30、CEA、EGFR、BRAF、HER-2、本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种共表达分泌型IL-7和选择性CCL19的表达载体，其特征在于，所述表达载体包括IL-6信号肽编码基因、IL-7编码基因、NFAT调控型启动子和CCL19编码基因。/n

【技术特征摘要】
1.一种共表达分泌型IL-7和选择性CCL19的表达载体，其特征在于，所述表达载体包括IL-6信号肽编码基因、IL-7编码基因、NFAT调控型启动子和CCL19编码基因。


2.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述IL-6信号肽编码基因包括SEQIDNO:1所示的核酸序列；
优选地，所述IL-7编码基因包括SEQIDNO:2所示的核酸序列；
优选地，所述NFAT调控型启动子包括SEQIDNO:3所示的核酸序列；
优选地，所述CCL19编码基因包括SEQIDNO:4所示的核酸序列。


3.根据权利要求1或2所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体包括病毒载体；
优选地，所述病毒载体包括慢病毒载体、逆转录病毒载体或腺相关病毒载体中的任意一种，优选为慢病毒载体。


4.一种重组慢病毒，其特征在于，所述重组慢病毒采用权利要求1-3任一项所述的表达载体与包装辅助质粒共转染哺乳细胞制备得到；
优选地，所述哺乳细胞包括293细胞、293T细胞或293F细胞中的任意一种或至少两种的组合。


5.一种嵌合抗原受体T细胞，其特征在于，所述嵌合抗原受体T细胞表达特异性结合肿瘤抗原的嵌合抗原受体、分泌型IL-7和选择性CCL19；
优选地，所述嵌合抗原受体T细胞包括权利要求1-3任一项所述的表达载体和/或权利要求4所述的重组慢病毒。


6.根据权利要求5所述的嵌合抗原受体T细胞，其特征在于，所述嵌合抗原受体包括信号肽、抗原结合结构域、跨膜结构域和信号传导结构域；
优选地，所述抗原结合结构域结合肿瘤表面抗原，所述肿瘤表面抗原包括CD19、CD20、CD22、CD30、CEA、EGFR、BRAF、HER-2、Mesothelin...

【专利技术属性】
技术研发人员：汤朝阳，秦乐，吴迪，魏志辉，王翠花，王艳艳，其他发明人请求不公开姓名，
申请(专利权)人：广东昭泰体内生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44