一种嵌合抗原受体T细胞及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种嵌合抗原受体T细胞及其应用，制备所述嵌合抗原受体T细胞的表达载体系统包括：含有嵌合抗原受体编码基因的第一表达载体，含有IL‑2信号肽编码基因和IL‑7编码基因的第二表达载体，含有NFAT调控型启动子和CCL19编码基因的第三表达载体；所述NFAT调控型启动子包括NFAT调控序列和启动子序列；所述NFAT调控序列包括SEQ ID NO:1所示的核酸序列。本发明专利技术将IL‑7信号肽替换为T细胞分泌蛋白IL‑2的信号肽，采用NFAT调控型启动子调控T细胞对CCL19的表达，实现了CAR‑T细胞分泌性表达IL‑7和NFAT调控型表达CCL19。

【技术实现步骤摘要】
一种嵌合抗原受体T细胞及其应用
本专利技术属于生物医药
，涉及一种嵌合抗原受体T细胞及其应用。
技术介绍
嵌合抗原受体T细胞(ChimericantigenreceptorTcell，CAR-T)免疫治疗是通过在T细胞膜上表达特异性识别并结合肿瘤抗原的嵌合抗原受体分子，诱导T细胞活化，从而实现对肿瘤细胞特异性杀伤的一种技术，是最有发展前景的肿瘤免疫疗法之一。目前，CAR-T免疫治疗方法在白血病治疗领域取得了巨大突破，但是在实体瘤的治疗上仍然存在诸多问题。科研人员通过对CAR-T疗法进行改进和优化，提高CAR-T对实体瘤的治疗效果。CN109504660A公开了一种第四代CAR-T细胞及其构建方法和应用，所述CAR包括胞膜外抗原结合区、铰链区和胞内信号传导区、细胞因子信号区，其中，胞膜外抗原结合区以Nectin-4抗原的两个空间表位为靶点，细胞因子信号区为IL7和CCL19，但是存在外源IL-7蛋白无法分泌到T细胞外、CCL19的持续性分泌无法最大程度将外周血免疫细胞招募到肿瘤内部的问题。因此，构建一种新型CAR-T细胞，不仅能分泌IL-7和CCL19，而且能将外源IL-7蛋白分泌到T细胞外，同时CCL19最大程度将外周血免疫细胞招募到肿瘤内部，在肿瘤的治疗领域具有重要意义。
技术实现思路
针对现有技术的不足和实际需求，本专利技术提供了一种嵌合抗原受体T细胞及其应用，所述嵌合抗原受体T细胞能够将IL-7持续性分泌到胞外，在识别肿瘤抗原后表达分泌CCL19，显著提高了CAR-T细胞的抗肿瘤效果，同时规避了由于持续性分泌CCL19导致非肿瘤组织环境过多募集免疫细胞可能引起的炎症副反应。为达此目的，本专利技术采用以下技术方案：第一方面，本专利技术提供了一种制备CAR-T细胞的表达载体系统，所述表达载体系统包括：含有嵌合抗原受体编码基因的第一表达载体，含有IL-2信号肽编码基因和IL-7编码基因的第二表达载体，含有NFAT调控型启动子和CCL19编码基因的第三表达载体；所述NFAT调控型启动子包括NFAT调控序列和启动子序列；所述NFAT调控序列包括SEQIDNO:1所示的核酸序列；SEQIDNO:1：agcgctccaaat。本专利技术中，将IL-7信号肽替换为T细胞分泌蛋白IL-2的信号肽，使得IL-7可以分泌到T细胞外，充分发挥IL-7对T细胞增殖的促进作用；采用NFAT调控型启动子调控T细胞对CCL19的表达，保证CAR-T细胞在肿瘤内部时才表达分泌CCL19，实现了外周血免疫细胞最大程度被招募到肿瘤内部的效果。优选地，所述嵌合抗原受体包括信号肽、抗原结合结构域、跨膜结构域和信号传导结构域。优选地，所述抗原结合结构域结合肿瘤表面抗原，所述肿瘤表面抗原包括CD19、CD20、CD22、CD30、CEA、EGFR、BRAF、HER-2、Mesothelin、MUC1、PSCA、GPC3、TERT、PTEN、PD-1、PD-L1或VEGF中的任意一种，优选为CD19、MUC1、GPC3、Mesothelin、PSCA或HER2中的任意一种，进一步优选为MUC1。优选地，所述跨膜结构域包括CD28跨膜结构域和/或CD8α跨膜结构域，优选为CD28跨膜结构域。优选地，所述信号传导结构域包括CD28胞内结构域、CD3ζ、TLR2、4-1BB、TLR1、CD27、OX40或DAP10中的任意一种或至少两种的组合，优选为CD28胞内结构域、CD3ζ和TLR2的组合。优选地，所述嵌合抗原受体由GM-CSF信号肽、MUC1抗原结合结构域、CD28跨膜结构域、CD28胞内结构域、CD3ζ和TLR2串联组成。优选地，所述嵌合抗体受体编码基因包括SEQIDNO:2所示的核酸序列；SEQIDNO:2：atgcttctcctggtgacaagccttctgctctgtgagttaccacacccagcattcctcctggatatcgttgtgactcaggaatctgcactcaccacatcacctggtgaaacagtcacactcacttgtcgctcaagtactggggctgttacaacaagtaactatgccaactgggtccaagaaaaaccagatcatttattcactggtctaataggtggtaccaacaaccgagcaccaggtgttcctgccagattctcaggctccctgattggagacaaggctgccctcaccatcacaggggcacagactgaggatgaggcaatatatttctgtgctctatggtacagcaaccattgggtgttcggtggaggaaccaaactgactgtcctaggatccgagggtggctcaggatcgggtggatcaggctctggtggctcaggatcggaggtccagctgcagcagtcaggaggaggcttggtgcaacctggaggatccatgaaactctcctgtgttgcctctggattcactttcagtaactactggatgaactgggtccgccagtctccagagaaggggcttgagtgggttgctgaaattagattgaaatctaataattatgcaacacattatgcggagtctgtgaaagggaggttcaccatctcaagagatgattccaaaagtagtgtctacctgcaaatgaacaacttaagagctgaagacactggcatttattactgtacctttggtaactcctttgcttactggggccaagggaccacggtcaccgtctcctcaattgaagttatgtatcctcctccttacctagacaatgagaagagcaatggaaccattatccatgtgaaagggaaacacctttgtccaagtcccctatttcccggaccttctaagcccttttgggtgctggtggtggttgggggagtcctggcttgctatagcttgctagtaacagtggcctttattattttctgggtgaggagtaagaggagcaggctcctgcacagtgactacatgaacatgactccccgccgccccgggcccacccgcaagcattaccagccctatgccccaccacgcgacttcgcagcctatcgctccagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaag本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种制备CAR-T细胞的表达载体系统，其特征在于，所述表达载体系统包括：/n含有嵌合抗原受体编码基因的第一表达载体，含有IL-2信号肽编码基因和IL-7编码基因的第二表达载体，含有NFAT调控型启动子和CCL19编码基因的第三表达载体；/n所述NFAT调控型启动子包括NFAT调控序列和启动子序列；/n所述NFAT调控序列包括SEQ ID NO:1所示的核酸序列。/n

【技术特征摘要】
1.一种制备CAR-T细胞的表达载体系统，其特征在于，所述表达载体系统包括：
含有嵌合抗原受体编码基因的第一表达载体，含有IL-2信号肽编码基因和IL-7编码基因的第二表达载体，含有NFAT调控型启动子和CCL19编码基因的第三表达载体；
所述NFAT调控型启动子包括NFAT调控序列和启动子序列；
所述NFAT调控序列包括SEQIDNO:1所示的核酸序列。


2.根据权利要求1所述的表达载体系统，其特征在于，所述嵌合抗原受体包括信号肽、抗原结合结构域、跨膜结构域和信号传导结构域；
优选地，所述抗原结合结构域结合肿瘤表面抗原，所述肿瘤表面抗原包括CD19、CD20、CD22、CD30、CEA、EGFR、BRAF、HER-2、Mesothelin、MUC1、PSCA、GPC3、TERT、PTEN、PD-1、PD-L1或VEGF中的任意一种，优选为CD19、MUC1、GPC3、Mesothelin、PSCA或HER2中的任意一种，进一步优选为MUC1；
优选地，所述跨膜结构域包括CD28跨膜结构域和/或CD8α跨膜结构域，优选为CD28跨膜结构域；
优选地，所述信号传导结构域包括CD28胞内结构域、CD3ζ、TLR2、4-1BB、TLR1、CD27、OX40或DAP10中的任意一种或至少两种的组合，优选为CD28胞内结构域、CD3ζ和TLR2的组合；
优选地，所述嵌合抗原受体由GM-CSF信号肽、MUC1抗原结合结构域、CD28跨膜结构域、CD28胞内结构域、CD3ζ和TLR2串联组成；
优选地，所述嵌合抗体受体编码基因包括SEQIDNO:2所示的核酸序列。


3.根据权利要求1或2所述的表达载体系统，其特征在于，所述IL-2信号肽编码基因包括SEQIDNO:3所示的核酸序列；
优选地，所述IL-7编码基因包括SEQIDNO:4所示的核酸序列。


4.根据权利要求1-3任一项所述的表达载体系统，其特征在于，所述NFAT调控型启动子包括SEQIDNO:5所示的核酸序列；
优...

【专利技术属性】
技术研发人员：汤朝阳，秦乐，吴迪，魏志辉，王翠花，王艳艳，其他发明人请求不公开姓名，
申请(专利权)人：广东昭泰体内生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44