一种糖蛋白MUC16原位稳定过表达方法技术

本发明专利技术公开一种糖蛋白MUC16原位稳定过表达方法，属于生物医药技术领域。本发明专利技术所述方法利用MUC16特异性的sgRNA定位dCas9到基因组DNA上MUC16基因的启动子区，通过dCas9融合的VP64结合MS2‑P65‑HSF1，在定位点最大程度募集转录起始复合体，有效实现MUC16基因的原位转录激活；慢病毒系统能够把过表达的所需元件(MUC16‑sgRNA，dCAS‑VP64，MS2‑P65‑HSF1)整合到细胞的基因组DNA中，跟随细胞分裂复制，实现细胞株MUC16的稳定过表达；本发明专利技术实现了常规载体难以克隆的大分子糖蛋白MUC16的原位稳定过表达。

【技术实现步骤摘要】
一种糖蛋白MUC16原位稳定过表达方法
本专利技术涉及一种糖蛋白MUC16原位稳定过表达方法，属于生物医药

技术介绍
现有方法中，质粒载体多用于目的基因的瞬时过表达，由于质粒无法整合到细胞基因组DNA中，目的基因会随着细胞分裂逐渐丢失。慢病毒载体可以把目的基因整合到细胞基因组DNA中，实现稳定过表达。无论是利用质粒或病毒载体实现过表达，都需要将目的基因序列克隆到载体中，通过增加基因拷贝数的方式提高表达量，克隆片段的大小受载体的容量限制。如果目的基因的mRNA片段过大，超出载体容量，则不能有效构建。例如：慢病毒载体目的基因的最大极限是4kb左右。腺病毒载体的最大容量在5-8kb。腺相关病毒只能容纳小于3kb的插入片段。质粒一般只能容纳小于10kb的外源DNA片段。一般情况下，外源DNA片段越长，越难插入，越不稳定，转化效率越低。MUC16是一个由14507个氨基酸组成的大分子糖蛋白，分子量1519175Da，其mRNA长43816bp(相当于约43.8kb)。现有质粒载体和慢病毒载体不适于容纳如此大的目的基因。>Lenti-CRI本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种糖蛋白MUC16原位稳定过表达方法，其特征在于，具体包括以下步骤：/n(1)sgRNA的设计：将转录起始位点上游200bp的碱基序列输入设计网站CRISPRdirect，选择智人作为参考基因组，得到能够靶向该区域的所有sgRNA，从中筛选出特异性高的sgRNA序列用于载体构建；/nMUC16过表达sgRNA的序列：SEQ ID NO.1；/nMUC16-sgRNA-1：GGTTTCTAAGACATCACACA；/nMUC16-sgRNA-2：AGGGAAGAATTGAGATCATC；/nMUC16-sgRNA-3：TGAGATTTGGTCTTCTCAAT；/n(2)使用BsmBI消化l...

【技术特征摘要】
1.一种糖蛋白MUC16原位稳定过表达方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
(1)sgRNA的设计：将转录起始位点上游200bp的碱基序列输入设计网站CRISPRdirect，选择智人作为参考基因组，得到能够靶向该区域的所有sgRNA，从中筛选出特异性高的sgRNA序列用于载体构建；
MUC16过表达sgRNA的序列：SEQIDNO.1；
MUC16-sgRNA-1：GGTTTCTAAGACATCACACA；
MUC16-sgRNA-2：AGGGAAGAATTGAGATCATC；
MUC16-sgRNA-3：TGAGATTTGGTCTTCTCAAT；
(2)使用BsmBI消化lentisgRNAzeobackbone载体，胶回收纯化消化好的载体；对sgRNA退火，将消化好的载体与退火sgRNA进行连接反应；
(3)步骤(2)得到的连接产物直接转化大肠杆菌Stbl3感受态，转化后的菌液涂布于带氨苄抗性的LB培养平板；37度静置培养过夜；
(4)从步骤(3)中的培养平板中挑取单克隆，接种于带氨苄抗性的液体培养基中，培养过夜，经过测序鉴定得到插入sgRNA的载体lentisgRNA；
(5)步骤(4)得到的载体和包装载体一同使用包装慢病毒，然后利用包装好的慢病毒感染目的细胞。


2.根据权利要求1所述糖蛋白MUC16原位稳定过表达方法，其特征在于：慢病毒包装的具体过程为：
①提前24小时用多聚赖氨酸poly-L-lysine包被细胞培养皿并晾干，以促进包装细胞贴壁；
②将5-8×106数量级的包装细胞悬于10ml完全培养基，铺到前期用多聚赖...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈颖，李光剑，丁晓洁，杨震林，郭威，孙远，宁明杰，
申请(专利权)人：云南省肿瘤医院昆明医科大学第三附属医院，
类型：发明
国别省市：云南;53