一种糖蛋白MUC16原位稳定过表达方法技术

本发明专利技术公开一种糖蛋白MUC16原位稳定过表达方法，属于生物医药技术领域。本发明专利技术所述方法利用MUC16特异性的sgRNA定位dCas9到基因组DNA上MUC16基因的启动子区，通过dCas9融合的VP64结合MS2‑P65‑HSF1，在定位点最大程度募集转录起始复合体，有效实现MUC16基因的原位转录激活；慢病毒系统能够把过表达的所需元件(MUC16‑sgRNA，dCAS‑VP64，MS2‑P65‑HSF1)整合到细胞的基因组DNA中，跟随细胞分裂复制，实现细胞株MUC16的稳定过表达；本发明专利技术实现了常规载体难以克隆的大分子糖蛋白MUC16的原位稳定过表达。

【技术实现步骤摘要】
一种糖蛋白MUC16原位稳定过表达方法
本专利技术涉及一种糖蛋白MUC16原位稳定过表达方法，属于生物医药

技术介绍
现有方法中，质粒载体多用于目的基因的瞬时过表达，由于质粒无法整合到细胞基因组DNA中，目的基因会随着细胞分裂逐渐丢失。慢病毒载体可以把目的基因整合到细胞基因组DNA中，实现稳定过表达。无论是利用质粒或病毒载体实现过表达，都需要将目的基因序列克隆到载体中，通过增加基因拷贝数的方式提高表达量，克隆片段的大小受载体的容量限制。如果目的基因的mRNA片段过大，超出载体容量，则不能有效构建。例如：慢病毒载体目的基因的最大极限是4kb左右。腺病毒载体的最大容量在5-8kb。腺相关病毒只能容纳小于3kb的插入片段。质粒一般只能容纳小于10kb的外源DNA片段。一般情况下，外源DNA片段越长，越难插入，越不稳定，转化效率越低。MUC16是一个由14507个氨基酸组成的大分子糖蛋白，分子量1519175Da，其mRNA长43816bp(相当于约43.8kb)。现有质粒载体和慢病毒载体不适于容纳如此大的目的基因。Lenti-CRISPR-dCas9慢病毒过表达系统适用于蛋白编码基因和LincRNA，其中dCas9代表无酶活的Cas9，不剪切基因组DNA。过表达系统包括两个重要原件：dCAS-VP64，dCas9和转录激活结构域VP64的融合蛋白，以及MS2-P65-HSF1，三个转录激活结构域的融合蛋白；两者都具备募集转录因子激活表达的功能，二者协同能最大程度实现基因过表达。Lenti-CRISPR-dCas9慢病毒系统利用sgRNA定位dCas9到基因组DNA上目标基因的启动子区，通过dCas9融合的VP64结合MS2-P65-HSF1，在定位点最大程度募集转录起始复合体，有效实现基因的原位转录激活。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种糖蛋白MUC16原位稳定过表达方法，使用Lenti-CRISPR-dCas9系统从基因组DNA上目标基因的启动子区直接增强转录提高表达量，无需大片段克隆构建，尤其适用于大基因的过表达，具体包括以下步骤：(1)sgRNA的设计：转录激活sgRNA的设计要求特异性的靶向目的基因启动子区域，在目标物种基因组DNA上无其他结合位点；因为转录起始位点上游200bp为转录激活的最佳区间，将此区域的碱基序列输入设计网站CRISPRdirect，物种选择为智人作为参考基因组，得到能够靶向该区域的所有sgRNA，从中筛选出特异性高的sgRNA序列用于载体构建。MUC16过表达sgRNA的序列：SEQIDNO.1；MUC16-sgRNA-1：GGTTTCTAAGACATCACACA；MUC16-sgRNA-2：AGGGAAGAATTGAGATCATC；MUC16-sgRNA-3：TGAGATTTGGTCTTCTCAAT。(2)使用BsmBI消化lentisgRNAzeobackbone载体，胶回收纯化消化好的载体；对sgRNA退火，将消化好的载体与退火sgRNA进行连接反应。(3)步骤(2)得到的连接产物直接转化大肠杆菌Stbl3感受态，转化后的菌液涂布于带氨苄抗性(100μg/mL)的LB培养平板；37度静置培养过夜。(4)从步骤(3)中的培养平板中挑取单克隆，接种于带氨苄抗性的液体培养基中，培养过夜，经过测序鉴定得到插入sgRNA的载体lentisgRNA。(5)步骤(4)得到的载体和包装载体一同使用包装慢病毒，然后利用包装好的慢病毒感染目的细胞。优选的，本专利技术所述慢病毒包装的具体过程为：①提前24小时用多聚赖氨酸poly-L-lysine包被细胞培养皿并晾干，以促进包装细胞贴壁。②将5-8×106数量级的包装细胞(这里指的是293T细胞)悬于10ml完全培养基，铺到前期用多聚赖氨酸包被过的10cm2培养皿中。③第二天当细胞融合度达到65％～80％时，弃去培养基用无菌PBS洗3遍，更换为含10％FBS的无抗生素培养基。④将pVSVG包膜质粒，pSPAX包装质粒及载体lentisgRNA按比例混合于无抗生素无血清的opti-MEM培养基中；各质粒比例：pVSVG:1μg，pSPAX:3μg，lentidCAS-VP64_Blast:1.5μg，lentiMS2-P65-HSF1_Hygro：1.5μg,lentisgRNA(MS2):1.5μg，3个sgRNA等比例混合。⑤转染试剂Lipofectamine2000，提前溶于等体积的无抗生素无血清的opti-MEM培养基中，随后与质粒混合体系充分混匀，室温静置反应20-30min，形成的DNA脂质体复合物均匀滴加到包装细胞培养皿中转染包装细胞。⑥24小时后更换完全培养基，随后的48、72小时收获含慢病毒的培养上清病毒培养上清需分装后于-80℃保存。优选的，本专利技术所述用慢病毒载体感染目的细胞的具体过程为：①慢病毒培养上清静置于冰上缓慢化冻，化冻后仍然置于冰上。②含慢病毒的培养上清需与等体积的完全培养基混匀以补充营养物质，并添加基因转染增强剂polybrene至最终浓度为8ug/ml。③目的细胞提前一天传代，当目的细胞达到55-75％融合度时弃去原培养液，加入混合好的慢病毒培养上清，让病毒感染目的细胞，培养过夜后首先用无菌PBS洗3遍，然后更换为完全培养基让目的细胞继续生长。④感染72小时后收获细胞用于后续检测。本专利技术利用MUC16特异性的sgRNA定位dCas9到基因组DNA上MUC16基因的启动子区，通过dCas9融合的VP64结合MS2-P65-HSF1，在定位点最大程度募集转录起始复合体，有效实现MUC16基因的原位转录激活；并且，慢病毒系统能够把过表达的所需元件(MUC16-sgRNA，dCAS-VP64，MS2-P65-HSF1)整合到细胞的基因组DNA中，跟随细胞分裂复制，实现细胞株MUC16的稳定过表达。本专利技术的有益效果：(1)本专利技术实现了常规载体难以克隆的大分子糖蛋白MUC16的原位稳定过表达。解决大分子蛋白难以构建过表达载体的问题：慢病毒载体目的基因的最大极限是4kb左右。腺病毒载体的最大容量在5-8kb。腺相关病毒只能容纳小于3kb的插入片段。质粒一般只能容纳小于10kb的外源DNA片段。一般情况下，外源DNA片段越长，越难插入，越不稳定，转化效率越低。MUC16是一个由14507个氨基酸组成的大分子糖蛋白，分子量1519175Da，其mRNA长43816bp(相当于约43.8kb)。现有质粒载体和慢病毒载体不适于容纳如此大的目的基因。Lenti-CRISPR-dCas9系统从基因组DNA上目标基因的启动子区直接增强转录提高表达量，无需大片段克隆构建，尤其适用于大基因的过表达。(2)原位：从细胞基因组DNA上MUC16的启动子区直接增强转录，实现MUC16的过表达，更能真实的放映增加细胞自身MUC16的生理或病理效应。其他的异位本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种糖蛋白MUC16原位稳定过表达方法，其特征在于，具体包括以下步骤：/n(1)sgRNA的设计：将转录起始位点上游200bp的碱基序列输入设计网站CRISPRdirect，选择智人作为参考基因组，得到能够靶向该区域的所有sgRNA，从中筛选出特异性高的sgRNA序列用于载体构建；/nMUC16过表达sgRNA的序列：SEQ ID NO.1；/nMUC16-sgRNA-1：GGTTTCTAAGACATCACACA；/nMUC16-sgRNA-2：AGGGAAGAATTGAGATCATC；/nMUC16-sgRNA-3：TGAGATTTGGTCTTCTCAAT；/n(2)使用BsmBI消化lenti sgRNA zeo backbone载体，胶回收纯化消化好的载体；对sgRNA退火，将消化好的载体与退火sgRNA进行连接反应；/n(3)步骤(2)得到的连接产物直接转化大肠杆菌Stbl3感受态，转化后的菌液涂布于带氨苄抗性的LB培养平板；37度静置培养过夜；/n(4)从步骤(3)中的培养平板中挑取单克隆，接种于带氨苄抗性的液体培养基中，培养过夜，经过测序鉴定得到插入sgRNA的载体lenti sgRNA；/n(5)步骤(4)得到的载体和包装载体一同使用包装慢病毒，然后利用包装好的慢病毒感染目的细胞。/n...

【技术特征摘要】
1.一种糖蛋白MUC16原位稳定过表达方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
(1)sgRNA的设计：将转录起始位点上游200bp的碱基序列输入设计网站CRISPRdirect，选择智人作为参考基因组，得到能够靶向该区域的所有sgRNA，从中筛选出特异性高的sgRNA序列用于载体构建；
MUC16过表达sgRNA的序列：SEQIDNO.1；
MUC16-sgRNA-1：GGTTTCTAAGACATCACACA；
MUC16-sgRNA-2：AGGGAAGAATTGAGATCATC；
MUC16-sgRNA-3：TGAGATTTGGTCTTCTCAAT；
(2)使用BsmBI消化lentisgRNAzeobackbone载体，胶回收纯化消化好的载体；对sgRNA退火，将消化好的载体与退火sgRNA进行连接反应；
(3)步骤(2)得到的连接产物直接转化大肠杆菌Stbl3感受态，转化后的菌液涂布于带氨苄抗性的LB培养平板；37度静置培养过夜；
(4)从步骤(3)中的培养平板中挑取单克隆，接种于带氨苄抗性的液体培养基中，培养过夜，经过测序鉴定得到插入sgRNA的载体lentisgRNA；
(5)步骤(4)得到的载体和包装载体一同使用包装慢病毒，然后利用包装好的慢病毒感染目的细胞。


2.根据权利要求1所述糖蛋白MUC16原位稳定过表达方法，其特征在于：慢病毒包装的具体过程为：
①提前24小时用多聚赖氨酸poly-L-lysine包被细胞培养皿并晾干，以促进包装细胞贴壁；
②将5-8×106数量级的包装细胞悬于10ml完全培养基，铺到前期用多聚赖...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈颖，李光剑，丁晓洁，杨震林，郭威，孙远，宁明杰，
申请(专利权)人：云南省肿瘤医院昆明医科大学第三附属医院，
类型：发明
国别省市：云南;53