本发明专利技术公开了一种逆转录病毒载体、应用及CAR‑T细胞杀伤功能评估方法，逆转录病毒载体包含编码IFN‑γ启动子和荧光蛋白基因的序列，所述荧光蛋白基因受所述IFN‑γ启动子的转录控制；CAR‑T细胞杀伤评估方法包括如下步骤：利用逆转录病毒载体感染CAR‑T细胞；将CAR‑T细胞与靶细胞共培养；取共培养后的细胞进行流式细胞分析，检测荧光蛋白基因表达情况。本发明专利技术逆转录病毒载体感染宿主CAR‑T细胞后，逆转录IFN‑γ启动子序列和荧光蛋白基因；宿主CAR‑T细胞受到靶细胞刺激时，激活IFN‑γ启动子序列，开始荧光蛋白基因和IFN‑γ基因的表达，通过检测荧光蛋白基因的表达情况能够分析IFN‑γ即γ干扰素的分泌情况；实现快速方便的CAR‑T杀伤功能评估方法，普及性强。
【技术实现步骤摘要】
逆转录病毒载体、应用及CAR-T细胞杀伤功能评估方法
本专利技术涉及CAR-T免疫细胞治疗
，具体涉及一种逆转录病毒载体和应用以及CAR-T细胞放行检测方法。
技术介绍
随着CAR(chimericantigenreceptor)技术的发展，正成为肿瘤免疫治疗的新星技术手段。慢病毒或逆转录病毒载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的基因治疗效果。目前慢病毒载体与逆转录病毒载体被广泛用于CAR-T免疫细胞治疗领域。在CAR-T研究中，常常需要对某种CAR-T进行体外细胞水平和体内小鼠肿瘤模型的功能验证。对CAR-T杀伤功能评估的重要指标之一就是IFN-γ的分泌水平；同时在临床研究中，由于在靶细胞刺激下会促进CAR-T细胞分泌IFN-γ，因此通常CAR-T产品的放行指标之一就是肿瘤抗原刺激下IFN-γ的分泌水平。目前通常使用Elisa试剂盒进行细胞因子的检测，但是Elisa检测耗费时间长，成本高，操作也较繁琐，不利于CAR-T细胞的快速放行检测。因此急需一种快速方便的检测受肿瘤抗原刺激后CAR-T细胞分泌IFN-γ情况的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种逆转录病毒载体和应用以及CAR-T细胞放行检测方法，以解决现有技术中采用Elisa试剂盒进行细胞因子的检测，检测耗费时间长，成本高，操作也较繁琐，不利于CAR-T细胞的快速放行检测的技术问题。为了实现上述目的，本专利技术的技术方案是：本专利技术第一方面公开了一种逆转录病毒载体，包含编码IFN-γ启动子和荧光蛋白基因的序列，所述荧光蛋白基因受所述IFN-γ启动子的转录控制。通过采用上述方案，本专利技术的逆转录病毒载体感染宿主CAR-T细胞后，能够逆转录IFN-γ启动子序列和荧光蛋白基因；当宿主CAR-T细胞受到靶细胞刺激时，会同时激活逆转录的IFN-γ启动子序列以及宿主DNA中的IFN-γ启动子序列，从而开始荧光蛋白基因和IFN-γ基因的表达，通过检测荧光蛋白基因的表达情况能够分析IFN-γ即γ干扰素的分泌情况，从而对CAR-T杀伤功能进行评估。在本专利技术的某一个实施例中，所述IFN-γ启动子序列为SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3、SEQIDNO.4所示序列中的一种。在本专利技术的某一个实施例中，所述荧光蛋白基因为GFP、EGFP、RFP、mcherry中的一种或多种组合。在本专利技术的某一个实施例中，所述逆转录病毒载体不包含增强子。通过采用上述方案，避免增强子增强荧光蛋白基因表达，从而影响对于荧光蛋白基因的表达情况与IFN-γ基因表达情况的相关性，影响分析结果。在本专利技术的某一个实施例中，所述逆转录病毒为慢病毒。本专利技术第二方面公开了包括上述逆转录病毒载体的CAR-T细胞。本专利技术第三方面公开了上述逆转录病毒载体在CAR-T细胞中的应用。本专利技术第四方面公开了上述逆转录病毒载体在CAR-T细胞杀伤功能评估中的应用。本专利技术第五方面公开了一种CAR-T细胞杀伤功能评估方法：包括如下步骤：S1利用如权利要求1至5任一所述的逆转录病毒载体感染CAR-T细胞；S2将步骤S1得到的CAR-T细胞与靶细胞共培养；S3取共培养后的细胞进行流式细胞分析，检测荧光蛋白基因表达情况。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：本专利技术逆转录病毒载体包含编码IFN-γ启动子和荧光蛋白基因的序列，在感染宿主CAR-T细胞后，能够逆转录IFN-γ启动子序列和荧光蛋白基因；当宿主CAR-T细胞受到靶细胞刺激时，会同时激活逆转录的IFN-γ启动子序列以及宿主DNA中的IFN-γ启动子序列，从而开始荧光蛋白基因和IFN-γ基因的表达，通过检测荧光蛋白基因的表达情况能够分析IFN-γ即γ干扰素的分泌情况，从而对CAR-T杀伤功能进行评估；相对于费时费力、操作繁琐、成本高的Elisa试剂盒检测方法，实现了快速方便的CAR-T杀伤功能评估方法，普及性强。附图说明为了更清楚地说明本专利技术具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。图1是本专利技术的实施例一的逆转录病毒载体构建结构示意图。图2是本专利技术的实施例二的GFP荧光表达情况细胞流式检测结果图。图3是本专利技术的对照例二的GFP荧光表达情况细胞流式检测结果图。图4是本专利技术的对照例一和对照例二中的Elisa试剂盒检测IFN-γ分泌数据对比图。具体实施方式下面将结合附图对本专利技术技术方案的实施例进行详细的描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本专利技术的技术方案，因此只作为示例，而不能以此来限制本专利技术的保护范围。需要注意的是，除非另有说明，本申请使用的技术术语或者科学术语应当为本专利技术所属领域技术人员所理解的通常意义。实施例一：如图1所示，本实施例提供了一种逆转录病毒载体，包含编码IFN-γ启动子和荧光蛋白基因的序列，其中荧光蛋白基因受到IFN-γ启动子的转录控制，即在逆转录后DNA序列上荧光蛋白基因位于IFN-γ启动子的下游。其中，逆转录病毒为慢病毒；IFN-γ启动子(pIFN)序列为SEQIDNO.1所示序列，同样也可以是SEQIDNO.1所示序列裁剪后得到的SEQIDNO.2、SEQIDNO.3或SEQIDNO.4中所示序列。荧光蛋白基因为GFP绿色荧光蛋白基因，同样也可以是EGFP、RFP、mcherry等常用荧光蛋白基因中的一种或多种组合，上述均为本领域常规技术手段。本实施例逆转录病毒载体不包含增强子，避免增强子增强荧光蛋白基因表达，从而影响荧光蛋白基因的表达情况与IFN-γ基因表达情况的相关性。实施例二：本实施例提供了实施例一的逆转录病毒载体即pIFN-GFP慢病毒载体的构建方法，包括如下步骤：1)将含有IFN-γ启动子基因片段的pUC57-CAR质粒，用NheI和XhoI进行双酶切，凝胶回收试剂盒(全式金)回收IFN-γ启动子基因片段。2)将慢病毒载体质粒pELNS-GFP用NheI和XhoI双酶切后，回收酶切后的产物，应用T4DNA连接酶(Takara)将载体片段和IFN-γ启动子片段进行连接。连接产物(pELNS-pIFN-GFP)转入感受态细胞进行扩增，提取质粒进行酶切鉴定与测序鉴定。3)用无内毒素质粒大提试剂盒(QIAGEN)提取pELNS-pIFN-GFP质粒、2个包装质粒pRSV-rev和pGAG-Pol，包膜蛋白质粒pVSV-G，使用分光光度计测定质粒的浓度。4)转染前一天，取2瓶T75培养的293T细胞，PBS洗一次后，加入胰酶消化细胞，细胞分散后，每瓶加入约5ml的DMEM完全培养基(10％胎牛血清，100U/ml青霉素，10本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种逆转录病毒载体，其特征在于，包含编码IFN-γ启动子和荧光蛋白基因的序列，所述荧光蛋白基因受所述IFN-γ启动子的转录控制。/n
【技术特征摘要】
1.一种逆转录病毒载体，其特征在于，包含编码IFN-γ启动子和荧光蛋白基因的序列，所述荧光蛋白基因受所述IFN-γ启动子的转录控制。
2.根据权利要求1所述的逆转录病毒载体，其特征在于，所述IFN-γ启动子序列为SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3、SEQIDNO.4所示序列中的一种。
3.根据权利要求1所述的逆转录病毒载体，其特征在于，所述荧光蛋白基因为GFP、EGFP、RFP、mcherry中的一种或多种组合。
4.根据权利要求1所述的逆转录病毒载体，其特征在于，不包含增强子。
5.根据权利要求1所述的逆转录病毒载体...
【专利技术属性】
技术研发人员：汪晨，张海，
申请(专利权)人：南京艾德免疫治疗研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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