一种长链非编码RNA-LINC00842原位过表达的阶梯微调方法技术

本发明专利技术公开一种长链非编码RNA‑LINC00842原位过表达的阶梯微调方法，该方法利用LINC00842特异性的sgRNA定位dCas9到基因组DNA上LINC00842基因的启动子区，通过dCas9融合的VP64结合MS2‑P65‑HSF1，在定位点以不同程度募集转录起始复合体，有效实现梯度调节LINC00842基因的原位过表达；并且，慢病毒系统能够把过表达的所需元件(LINC00842‑sgRNA，dCAS‑VP64，MS2‑P65‑HSF1)整合到细胞的基因组DNA中，跟随细胞分裂复制，实现细wer胞株LINC00842的稳定过表达，最终得到一组稳定过表达不同幅度的LINC00842基因的细胞株系列。

【技术实现步骤摘要】
一种长链非编码RNA-LINC00842原位过表达的阶梯微调方法
本专利技术涉及一种长链非编码RNA-LINC00842原位过表达的阶梯微调方法，属于原位过表达

技术介绍
以上调和下调方式研究基因功能非常普遍，其中上调一般通过质粒或病毒载体过表达目的基因实现，上调的量主要取决于所用的方法和载体能够达到的上调幅度，在选定的实验条件下是个相对稳定的量。其实，在细胞复杂的动态信号网络中，基因量变的方向和幅度都会影响细胞的状态和生理功能。目前的常用载体通常能够达到一个相对稳定量的上调，例如：在某种细胞中上调3倍左右；但是使用一个载体难以实现梯度调节目的基因的表达量，例如：依次上调2、3、4倍。通过调节量变幅度来更精细的研究基因功能是未来趋势，所以设计能够不同幅度上调目的基因表达量的载体系统，能为基因功能研究提供有应用价值的工具。现有的Tet-on/Tet-off调控系统可以通过调节加入药物的剂量和时间，一定程度上调控目的基因表达幅度。例如四环素调控开关，加入一定浓度的四环素可以开启或抑制外源基因的表达。能够被调控的是构建有Tet应答元件的目的基因表达载体，即外源引入的目的基因，而不是细胞自身基因组DNA上的目的基因。所得的表达量也是叠加了细胞自身目的基因表达量后的总和。并且加入的药物，用药计量及其作用时间也是影响细胞的生理或病理状态的变量，特别当研究细胞对其他药物的代谢或应答时，已经加入的诱导药物在一定程度上可能成为干扰变量。本专利技术提出一种不借助药物诱导，也不引入外源目的基因拷贝，通过直接作用于细胞自身基因组DNA中的目的基因，来实现梯度调节细胞自身目的基因的表达量方法，相当于一种细胞内原位调控，可以较为简便的获得一组稳定过表达不同幅度的同一目的基因的细胞株系列。(例如：上调2、3、4倍)这样有利于更精细的细胞功能或细胞行为对比研究。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种长链非编码RNA：LINC00842原位过表达的阶梯微调方法，使用Lenti-CRISPR-dCas9系统从基因组DNA上目标基因的启动子区直接调节转录水平，无需引入外源构建的目的基因，不依赖任何药物诱导，具体为：利用LINC00842特异性的sgRNA定位dCas9到基因组DNA上LINC00842基因的启动子区，通过dCas9融合的VP64结合MS2-P65-HSF1，在定位点以不同程度募集转录起始复合体，实现梯度调节LINC00842基因的原位过表达；并且，慢病毒系统能够把过表达的所需元件LINC00842-sgRNA，dCAS-VP64，MS2-P65-HSF1整合到细胞的基因组DNA中，跟随细胞分裂复制，实现细胞株LINC00842的稳定过表达，最终得到一组稳定过表达不同幅度的LINC00842基因的细胞株系列。优选的，本专利技术所述方法具体包括以下步骤：(1)sgRNA的设计：转录激活sgRNA的设计要求特异性的靶向目的基因启动子区域，在目标物种基因组DNA上无其他结合位点。将转录起始位点及其上游900bp的碱基序列输入设计网站CRISPRdirect，物种选择为智人作为参考基因组，得到能够靶向该区域的所有sgRNA，从中筛选出特异性高的sgRNA序列用于载体构建。LINC00842过表达sgRNA的序列：LINC00842-sgRNA-1：TCCCTGTGCCCAGCTAACTGLINC00842-sgRNA-2：TTGCTCCCCGGAAGACCCCTLINC00842-sgRNA-3：CAGGTGTCTAAGTTCCCTCG(2)使用BsmBI消化lentisgRNAzeobackbone载体，胶回收纯化消化好的载体；对sgRNA退火，将消化好的载体与退火sgRNA进行连接反应。(3)步骤(2)得到的连接产物直接转化大肠杆菌Stbl3感受态，转化后的菌液涂布于带氨苄抗性(100μg/mL)的LB培养平板；37度静置培养过夜。(4)从步骤(3)中的培养平板中挑取单克隆，接种于带氨苄抗性的液体培养基中，培养过夜，经过测序鉴定得到插入sgRNA的载体lentisgRNA。(5)步骤(4)得到的载体和包装载体一同使用包装慢病毒，然后利用包装好的慢病毒感染目的细胞。优选的，本专利技术所述慢病毒包装的具体过程为：(1)提前24小时用多聚赖氨酸poly-L-lysine包被细胞培养皿并晾干，以促进包装细胞贴壁。(2)将5-8×106数量级的包装细胞293T细胞悬于10ml完全培养基，铺到前期用多聚赖氨酸包被过的10cm2培养皿中。(3)第二天当细胞融合度达到65％～80％时，弃去培养基用无菌PBS洗3遍，更换为含10％FBS的无抗生素培养基。(4)将pVSVG包膜质粒，pSPAX包装质粒及目的基因质粒(步骤(4)中的载体)按比例混合于无抗生素无血清的opti-MEM培养基中；各质粒比例：pVSVG:1μg，pSPAX:3μg，lentidCAS-VP64_Blast:1.5μg，lentiMS2-P65-HSF1_Hygro：1.5μg,lentisgRNA(MS2):1.5μg，(如果使用多个sgRNA组合，则各个sgRNA等比例混合)。(5)转染试剂Lipofectamine2000，提前溶于等体积的无抗生素无血清的opti-MEM培养基中，随后与质粒混合体系充分混匀，室温静置反应20-30min，形成的DNA脂质体复合物均匀滴加到包装细胞培养皿中转染包装细胞。(6)24小时后更换完全培养基，随后的48、72小时收获含慢病毒的培养上清病毒培养上清需分装后于-80℃保存。优选的，本专利技术所述用慢病毒载体感染目的细胞的具体过程为：(1)慢病毒培养上清静置于冰上缓慢化冻，化冻后仍然置于冰上。(2)含慢病毒的培养上清需与等体积的完全培养基混匀以补充营养物质，并添加基因转染增强剂polybrene至最终浓度为8ug/ml。(3)目的细胞提前一天传代，当目的细胞达到55-75％融合度时弃去原培养液，加入混合好的慢病毒培养上清，让病毒感染目的细胞，培养过夜后首先用无菌PBS洗3遍，然后更换为完全培养基让目的细胞继续生长。(4)感染72小时后收获细胞用于后续检测。本专利技术所述阶梯微调载体构建原理：Lenti-CRISPR-dCas9慢病毒过表达系统适用于蛋白编码基因和LincRNA，其中dCas9代表无酶活的Cas9，不剪切基因组DNA；过表达系统包括两个重要原件：dCAS-VP64，dCas9和转录激活结构域VP64的融合蛋白，以及MS2-P65-HSF1，三个转录激活结构域的融合蛋白；Lenti-CRISPR-dCas9慢病毒系统利用sgRNA定位dCas9到基因组DNA上目标基因的启动子区，通过dCas9融合的VP64结合MS2-P65-HSF1，在定位点最大程度募集转录起始复合体，有效实现基因的原位转录激活。该系统的两个重要原件：dCAS-VP64和MS2-P65-HS本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种长链非编码RNA-LINC00842原位过表达的阶梯微调方法，其特征在于：使用Lenti-CRISPR-dCas9系统从基因组DNA上目标基因的启动子区直接调节转录水平，无需引入外源构建的目的基因，不依赖任何药物诱导，具体为：利用LINC00842特异性的sgRNA定位dCas9到基因组DNA上LINC00842基因的启动子区，通过dCas9融合的VP64结合MS2-P65-HSF1，在定位点以不同程度募集转录起始复合体，实现梯度调节LINC00842基因的原位过表达；并且，慢病毒系统能够把过表达的所需元件LINC00842-sgRNA，dCAS-VP64，MS2-P65-HSF1整合到细胞的基因组DNA中，跟随细胞分裂复制，实现细胞株LINC00842的稳定过表达，最终得到一组稳定过表达不同幅度的LINC00842基因的细胞株系列。/n

【技术特征摘要】
1.一种长链非编码RNA-LINC00842原位过表达的阶梯微调方法，其特征在于：使用Lenti-CRISPR-dCas9系统从基因组DNA上目标基因的启动子区直接调节转录水平，无需引入外源构建的目的基因，不依赖任何药物诱导，具体为：利用LINC00842特异性的sgRNA定位dCas9到基因组DNA上LINC00842基因的启动子区，通过dCas9融合的VP64结合MS2-P65-HSF1，在定位点以不同程度募集转录起始复合体，实现梯度调节LINC00842基因的原位过表达；并且，慢病毒系统能够把过表达的所需元件LINC00842-sgRNA，dCAS-VP64，MS2-P65-HSF1整合到细胞的基因组DNA中，跟随细胞分裂复制，实现细胞株LINC00842的稳定过表达，最终得到一组稳定过表达不同幅度的LINC00842基因的细胞株系列。


2.根据权利要求1所述长链非编码RNA-LINC00842原位过表达的阶梯微调方法，其特征在于：具体包括以下步骤：
(1)sgRNA的设计：将转录起始位点及其上游900bp的碱基序列输入设计网站CRISPRdirect，物种选择为人类作为参考基因组，得到能够靶向该区域的所有sgRNA，从中筛选出特异性高的sgRNA序列用于载体构建；
LINC00842过表达sgRNA的序列：
LINC00842-sgRNA-1：TCCCTGTGCCCAGCTAACTG
LINC00842-sgRNA-2：TTGCTCCCCGGAAGACCCCT
LINC00842-sgRNA-3：CAGGTGTCTAAGTTCCCTCG
(2)使用BsmBI消化lentisgRNAzeobackbone载体，胶回收纯化消化好的载体；对sgRNA退火，将消化好的载体与退火sgRNA进行连接反应；
(3)步骤(2)得到的连接产物直接转化大肠杆菌Stbl3感受态，转化后的菌液涂布于带氨苄抗性的LB培养平板上，静置培养过夜；
(4)从步骤(3)中的培养平板中挑取单克隆，接种于带氨苄抗性的液体培养基中，培养过夜，经过测序鉴定得到插入sgRNA的载体lentisgRNA；
(5)步骤(4)得到的载体和包装载体一同使用...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈颖，丁晓洁，郭威，杨震林，彭静，石剑林，明超，
申请(专利权)人：云南省肿瘤医院昆明医科大学第三附属医院，
类型：发明
国别省市：云南;53